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人CREG启动子报告基因质粒的构建及转录活性分析

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解放军医学杂志 2019年第7期44卷 585-592页

作者：刘姗刘美丽刘丹闫承慧田孝祥刘艳霞北部战区总医院心内科/全军心血管病研究所实验室/全军心血管急重症救治重点实验室/辽宁省心血管病转化医学研究重点实验室沈阳110016 国家老年疾病临床研究中心北部战区总医院老年医学中心干二科沈阳110016

目的构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特... 详细信息

目的构建人E1A激活基因阻遏子基因(hCREG)不同截短片段的启动子增强型绿色荧光蛋白(pEGFP1)报告基因载体,比较各启动子转录活性,从而确定hCREG核心启动子区。方法通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库hCREG序列并结合启动子特点,获得长度为2003(–1925/+78) bp的启动子片段。利用PCR法及双酶切法截短5个启动子片段并克隆至pEGFP1中,构建pEGFP1_hCREG_2003、pEGFP1_hCREG_945、pEGFP1_hCREG_586、pEGFP1_hCREG_478、pEGFP1_hCREG_358报告基因载体质粒。并将其与内参质粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬时共转染入293T细胞48 h,荧光显微镜下观察pEGFP1hCREG启动子报告基因的绿色荧光表达;采用实时定量PCR检测各启动子mRNA的表达,并确定核心启动子区。采用生物信息学方法预测核心启动子区可能结合的转录因子。结果通过双酶切和基因测序法证实成功构建5个hCREG启动子报告基因载体。荧光显微镜下的观察结果和实时定量PCR结果均显示,pEGFP_1hCREG_586转录活性最高(P0.05),提示–867/–509 bp为负性调控区,–400/–281 bp和–508/–401 bp均存在增强子序列,故hCREG基因核心启动子区位于基因5’上游序列–508/–281 bp区域。生物信息学预测关键启动子区–508/–281 bp可能结合的转录因子为Pax5/P53、C/EBPβ、GR-β、GATA-1、GR-α、c-Jun、PRB/PRA、YY1、RXR-α、AP-2、FOXP3、GR、TFIID、STAT4、c-Ets-1。结论成功构建了hCREG基因启动子重组质粒,其核心启动子位于–508/–281 bp区域,此区域可结合多个转录因子。

关键词： E1A激活基因阻遏子转录启动子报告基因质粒绿色荧光蛋白质类聚合酶链反应

犬小孢子菌丝氨酸水解酶家族1蛋白的亚细胞定位分析

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中华皮肤科杂志 2020年第12期53卷 998-1003页

作者：张芙蓉郭春梅谭灿刘洋徐宇杨国玲大连市友谊医院皮肤科 116001 大连医科大学基础医学院 116044 成都市第二人民医院皮肤科 610017 杭州市第三人民医院皮肤科 310009 成都市郫都区安靖镇卫生院 611731 大连医科大学附属第一医院皮肤科 116011

目的对丝氨酸水解酶家族1(FSH1)蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为模板,PCR扩增FSH1基因及EGFP基因;同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒... 详细信息

目的对丝氨酸水解酶家族1(FSH1)蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为模板,PCR扩增FSH1基因及EGFP基因;同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA,将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体;将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,用重组质粒转化犬小孢子菌,使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体;融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中,为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

关键词：小孢子菌属丝氨酸蛋白酶类绿色荧光蛋白质类犬小孢子菌 FSH1 亚细胞定位

绿色荧光蛋白标记的Raw264.7体外诱导分化为破骨细胞的实验研究

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中华口腔医学杂志 2015年第4期50卷 235-239页

作者：裴瑛波吕春阳刘浩天津市人民医院口腔科 300381 天津上谷爱齿口腔门诊部天津市口腔医院口腔颌面外科

目的观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）标记的Raw264.7体外分化为破骨细胞的能力,拟为EGFP基因作标志物对外源性破骨前体细胞进行体内追踪做准备.方法利用反转录病毒介导pEGFP-Lifeact基因转染Raw26... 详细信息

目的观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）标记的Raw264.7体外分化为破骨细胞的能力,拟为EGFP基因作标志物对外源性破骨前体细胞进行体内追踪做准备.方法利用反转录病毒介导pEGFP-Lifeact基因转染Raw264.7细胞;采用有限稀释技术,荧光显微镜下获得EGFP稳定转染的G3单克隆细胞并观察其形态,将稳定转染成功的细胞定为G3-EGFP转染组,未转染野生细胞作为对照组;核因子κB受体激活子配体（receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL）诱导G3细胞向破骨细胞分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色、蛋白质印迹法检测组织蛋白酶K、骨吸收陷窝实验观察转染后对破骨细胞形成和骨吸收功能的影响;激光共聚焦显微镜实时拍摄转染细胞向破骨细胞分化过程中伪足小体结构变化的动态影像.结果 Raw264.7细胞内成功转染EGFP-Lifeact,传至20代以上仍可稳定表达EGFP,建立了G3-EGFP单克隆细胞株;转染细胞无明显形态学变化,能诱导形成TRAP染色阳性的多核巨细胞,转染组细胞融合率为（35±5）％,对照组细胞融合率为（39±5）％,二者差异无统计学意义（P＞0.05）;免疫印迹实验中对照组与转染组中组织蛋白酶K/β-肌动蛋白半定量分析比值分别为0.83±0.07、1.02±0.08,两组细胞组织蛋白酶K表达差异无统计学意义（P＞0.05）;对照组与转染组骨吸收总面积分别为272 252±36 193和262 408±23 243（P＞0.05）,骨吸收陷窝数目分别为320±51和339±55 （P＞0.05）,表明转染不影响破骨细胞形成与骨吸收功能;激光共聚焦显微镜实时拍摄显示转染细胞向破骨细胞分化时不断发生细胞融合,伪足小体作为动态自组装结构不断发生改建,最初聚集形成伪足小体簇,逐渐形成环状结构,最终于成熟破骨细胞周围形成相对稳定的伪足小体带.结论 EGFP可成功标记Raw264.7细胞;转染并不影响Raw264.7细胞向破骨细胞分化的能力.

关键词：破骨细胞伪足微丝肌动蛋白质类绿色荧光蛋白质类

腺病毒载体携带标记基因EGFP转染人羊膜上皮细胞

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中国组织工程研究 2017年第21期21卷 3382-3387页

作者：金玲刘小勇徐玮郝晓宁牛静宜王乙婷曹端荣深圳市宝安人民医院眼科广东省深圳市518101 暨南大学附属第一医院眼科广东省广州市510630

背景:人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些性能,可诱导分化为角膜样上皮细胞,但在体外培养时无法示踪,不能有效地监测其细胞转归。目的:探讨利用腺病毒载体将标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞的可行性及感染效率。方法:pD C316-mC MV-EGFP... 详细信息

背景:人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些性能,可诱导分化为角膜样上皮细胞,但在体外培养时无法示踪,不能有效地监测其细胞转归。目的:探讨利用腺病毒载体将标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞的可行性及感染效率。方法:pD C316-mC MV-EGFP腺病毒包装后,腺病毒载体携带标记基因EGFP转染体外培养的人羊膜上皮细胞,并扩增培养,观察转染后人羊膜上皮细胞与未转染人羊膜上皮细胞的形态差异,并在荧光显微镜下观察转染基因的表达,用流式细胞仪检测转染细胞的细胞周期及EGFP阳性表达率。结果与结论:(1)多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人羊膜上皮细胞在形态上无显著差异;(2)瞬时转染后48 h的人羊膜上皮细胞中增强型绿色荧光蛋白阳性表达率最高达99.01%;(3)转染后的人羊膜上皮细胞的细胞周期有所减慢,说明利用腺病毒载体能将标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞,可更直观地观察到人羊膜上皮细胞在体外的进一步转归。

关键词：腺病毒科感染绿色荧光蛋白质类羊膜上皮细胞细胞周期组织工程干细胞培养腺病毒绿色荧光蛋白人羊膜上皮细胞原代培养扩增培养基因转染转染效率国家自然科学基金

腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性

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中国组织工程研究 2018年第17期22卷 2650-2655页

作者：武成聪荣树任静吴铮刘涛刘克廷朱博黄合飞王芳曲靖市第一人民医院骨一科云南省曲靖市655000 曲靖市第二人民医院病理科云南省曲靖市655000

背景:重组腺病毒对细胞生长、存活存在一定的毒性反应,其最适感染复数的确定相关研究较少。目的:研究重组腺病毒在不同感染复数下其转染效率、细胞毒性及对骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响。方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组... 详细信息

背景:重组腺病毒对细胞生长、存活存在一定的毒性反应,其最适感染复数的确定相关研究较少。目的:研究重组腺病毒在不同感染复数下其转染效率、细胞毒性及对骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响。方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺毒载体分别以感染复数为0,50,100,150,200,250转染第5代骨髓间充质干细胞。转染24 h后观察细胞形态,锥虫蓝染色计数死亡率;转染48 h后荧光倒置显微镜下计算转染率,q PCR检测EGFP及Runx2基因表达量。MTT法评价不同感染复数转染对细胞活性的影响,确定最佳感染复数。结果与结论:(1)随感染复数值增加,骨髓间充质干细胞贴壁能力减弱,部分细胞老化、死亡;(2)以感染复数值为0,50,100,150,200,250转染24 h,其细胞死亡率依次为5.80%,6.67%,7.95%,7.76%,10.35%,11.18%,死亡率与感染复数值成正相关;(3)当感染复数值为100时即可达到最大转染效率,但当感染复数增大至200时,细胞活性即受到影响;当感染复数达到250时,骨髓间充质干细胞成骨分化潜能受到影响;(4)通过上述结果可以认为,腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的感染复数安全范围为50-150,其最适感染复数为100。

关键词：骨髓间质干细胞腺病毒科绿色荧光蛋白质类组织工程干细胞骨髓间充质干细胞腺病毒感染复数细胞毒性国家自然科学基金

三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究

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浙江大学学报（医学版） 2013年第6期42卷 660-665页

作者：何星李华邵雁胡莹顾子春陈力马菁晶兰志勇浙江大学医学院附属邵逸夫医院整形科浙江杭州310016

目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察... 详细信息

目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。结果:HilyMax组的转染效率为(86.85%±2.32%),较Lipofectamin2000组(48.33%±3.24%)、Gbfectene-Elite组(37.35%±5.41%)高(F=18.882,P<0.05);其中,HilyMax 2.5μl组的转染效率最高为(90.53%±1.15%)。Lipofectamin2000组的细胞存活率(65.76%±5.78%)明显低于HilyMax组(89.54%±0.86%)、Gbfectene-Elite组(82.45%±3.56%)(F=90.676,P<0.05)。结论:HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5μl HilyMax:1μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。

关键词：转染,质粒DNA/遗传学鸡胚成纤维细胞/细胞学绿色荧光蛋白质类细胞毒性

三种携带GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞的效果

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中国组织工程研究 2017年第29期21卷 4642-4647页

作者：肖渝李彦林王坤李龙滕闫祥甲蒙旭晗昆明医科大学第一附属医院运动医学科云南省昆明市650000

背景:研究不同慢病毒对同一骨髓来源间充质干细胞的转染效果,筛选合适的细胞转染工具。目的:探究3种慢病毒对兔骨髓间充质干细胞转染效果的差异。方法:选择2周龄日本大耳白兔,髂骨穿刺抽取骨髓液,采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细... 详细信息

背景:研究不同慢病毒对同一骨髓来源间充质干细胞的转染效果,筛选合适的细胞转染工具。目的:探究3种慢病毒对兔骨髓间充质干细胞转染效果的差异。方法:选择2周龄日本大耳白兔,髂骨穿刺抽取骨髓液,采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志物表达。分别用p Tomo-GFP慢病毒、Ad-GFP慢病毒、lenti-GFP慢病毒转染骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测3种慢病毒的转染率。CCK-8法检测转染前后细胞生长活力变化。结果与结论:①培养出的细胞CD44阳性率为75.64%,CD34、CD45阳性率分别为6.14%、9.48%;②pTomo-GFP慢病毒转染后GFP表达率为2.64%、Ad-GFP慢病毒转染后GFP表达率为16.72%、lenti-GFP慢病毒转染后GFP表达率为45.24%;③各慢病毒对细胞生长存在一定影响。p Tomo-GFP、Ad-GFP在第1-8天对细胞生长潜伏期和对数生长期存在影响,可能对前期细胞活性造成一定干扰。短期内lenti-GFP对细胞生长影响不大,但第12天时出现了细胞生长情况变化,考虑对细胞远期活力存在影响;④选用lenti-GFP慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞能够在保证细胞正常生长的情况下提供最大的转染效率,适用于兔骨髓间充质干细胞的示踪及基因转染等相关研究。

关键词：慢病毒属骨髓间质干细胞绿色荧光蛋白质类组织工程

人血小板第4因子基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

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军事医学 2019年第10期43卷 733-738页

作者：姜佳楠覃金华范增何丽娟岳文郑敏李艳华裴雪涛电子科技大学医学院成都610054 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 华南生物医药研究院华南干细胞与再生医学研究中心广州510005 军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所北京100850

目的构建人血小板第4因子(PF4)基因启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245^+49 bp的DNA序列。以正常人全血基... 详细信息

目的构建人血小板第4因子(PF4)基因启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245^+49 bp的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP。将其包装慢病毒并感染MEG01细胞,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并用12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)诱导MEG01细胞分化成熟,通过流式细胞术检测GFP表达率,从而验证报告基因的转录活性。结果构建的载体PLVX-PF4-promoter-GFP经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转入MEG01细胞,经药物筛选获得了MEG01-PF4-GFP细胞株。流式细胞术检测结果表明,正常培养条件下的MEG01-PF4-GFP细胞中GFP阳性细胞率低[(5.467±0.2603)%],该细胞经PMA诱导分化后,GFP阳性细胞率显著升高[(24.93±2.571)%]。结论成功构建了人PF4启动子-GFP报告基因载体,为后续深入研究PF4基因的调控机制及巨核细胞发育分化的分子生物学机制奠定了基础。

关键词：血小板因子4 巨核细胞绿色荧光蛋白质类

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犬小孢菌PQ-LRP蛋白的定位研究

中华皮肤科杂志 2019年第3期52卷 189-192页

作者：刘洋徐宇张芙蓉谭灿杨国玲大连医科大学附属第一医院皮肤科 116011

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记犬小孢子菌PQ-LRP蛋白,明确PQ-LRP蛋白在犬小孢子菌中的定位。方法提取犬小孢子菌总RNA,反转录为cDNA作为模板,PCR扩增PQLRP基因,将PQ-LRP基因与EGFP基因构成融合基因,连接到pCAMBIA 1300质粒载体.... 详细信息

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记犬小孢子菌PQ-LRP蛋白,明确PQ-LRP蛋白在犬小孢子菌中的定位。方法提取犬小孢子菌总RNA,反转录为cDNA作为模板,PCR扩增PQLRP基因,将PQ-LRP基因与EGFP基因构成融合基因,连接到pCAMBIA 1300质粒载体.采用根癌农杆菌转化法对犬小孢子菌进行转化,使融合基因LRP-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的细胞定位。结果成功构建表达载体pCAMBIA-LRP-EGFP,融合基因LRP-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜下LRP-EGFP的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞膜上。结论LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中成功表达,且PQ-LRP蛋白定位于犬小孢子菌细胞膜上。

关键词：小孢子菌属定位标记绿色荧光蛋白质类犬小孢子菌 PQ-LRP 蛋白定位