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掌跖角化-牙周破坏综合征(一家系)组织蛋白酶C基因突变及功能分析

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口腔医学研究 2022年第7期38卷 616-621页

作者：彭海龙杨媛秦满北京大学口腔医学院儿童口腔科北京100081

目的:对一家系中2名掌跖角化-牙周破坏综合征(Papillon-Lefèvre syndrome,PLS)患者及父母进行cTSc基因突变检测,并对突变的组织蛋白酶C进行简要功能分析。方法:(1)针对一个PLS综合征家系,对其进行cTSc基因测序筛查。(2)对研究中发现的c... 详细信息

目的:对一家系中2名掌跖角化-牙周破坏综合征(Papillon-Lefèvre syndrome,PLS)患者及父母进行cTSc基因突变检测,并对突变的组织蛋白酶C进行简要功能分析。方法:(1)针对一个PLS综合征家系,对其进行cTSc基因测序筛查。(2)对研究中发现的cTSc基因突变位点,采用蛋白质结构预测服务器I-TASSER进行组织蛋白酶C蛋白结构预测分析。(3)提取患者及父母外周静脉血中白细胞,测定组织蛋白酶C的活性,并与正常组对比。结果:(1)本家系中2名PLS患者均发现第六、七外显子的c.774 c>G(p.c258W)和c.1033 T>A(p.Y345N)杂合错义突变,其中c.1033 T>A为首次报道。(2)以上两位点突变后蛋白构象与野生型对比,整体结构并未发生明显改变。(3)2名PLS患者的组织蛋白酶C活性较正常对照组平均降低约77%,父亲及母亲的组织蛋白酶C活性降低约23%及63%。结论:本研究中2例PLS患者均存在cTSc基因的复合型杂合子突变,突变位点为c.774 c>G(p.c258W)和c.1033 T>A(p.Y345N),其中c.1033 T>A为新发现的突变位点。该复合型杂合突变并未造成组织蛋白酶C蛋白结构改变,但会造成组织蛋白酶C活性减低。

关键词：掌跖角化-牙周破坏综合征 cTSc基因组织蛋白酶C 基因突变

一个掌跖角化-牙周破坏综合征患者家系组织蛋白酶C基因突变分析

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华西口腔医学杂志 2019年第1期37卷 31-36页

作者：胡婷婷邹小炎叶芳南昌大学附属口腔医院牙周科江西省口腔生物医学重点实验室南昌330006

目的对一个掌跖角化-牙周破坏综合征(PLS)患者及其家系组织蛋白酶C基因(cTSc)突变位点进行分析,探讨PLS的分子致病机制。方法提取1例PLS先证者及其直系血亲(父母、弟弟)的基因组DNA,应用聚合酶链反应和DNA直接测序技术分析先证者及其直... 详细信息

目的对一个掌跖角化-牙周破坏综合征(PLS)患者及其家系组织蛋白酶C基因(cTSc)突变位点进行分析,探讨PLS的分子致病机制。方法提取1例PLS先证者及其直系血亲(父母、弟弟)的基因组DNA,应用聚合酶链反应和DNA直接测序技术分析先证者及其直系血亲cTSc基因的突变情况。结果 PLS先证者cTSc基因存在复合型杂合突变。先证者位于外显子6的第800位碱基发生了一个杂合错义突变,该碱基对中的碱基T被c取代(c.800T>c),其编码的氨基酸由亮氨酸改变为脯氨酸(p.L267P);位于外显子7的第1015位碱基发生了一个杂合错义突变,该碱基对中的碱基c被T取代(c.1015c>T),其编码的氨基酸由精氨酸改变为半胱氨酸(p.R339c)。其中,c.800T>c来自母亲,c.1015c>T来自父亲,弟弟的cTSc基因未见突变。结论 PLS的临床表征与cTSc基因突变有关。

关键词：掌跖角化-牙周破坏综合征组织蛋白酶C 基因突变

组织蛋白酶C和肿瘤坏死因子α在人冠脉组织中的表达及其与冠心病的相关性研究

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中国病理生理杂志 2020年第12期36卷 2133-2138页

作者：张琼万昌武于燕妮夏冰刘江金张桥军李竹王承飞戴佳琳王杰贵州医科大学法医学院贵州贵阳550001

目的:检测组织蛋白酶C(cTSc)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在人冠状动脉组织中的表达,并探讨两者在冠心病中的可能作用机制。方法:收集贵州医科大学法医司法鉴定中心2018年10月~2019年12月的52例冠心病死亡案例的冠状动脉作为冠心病组,以同... 详细信息

目的:检测组织蛋白酶C(cTSc)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在人冠状动脉组织中的表达,并探讨两者在冠心病中的可能作用机制。方法:收集贵州医科大学法医司法鉴定中心2018年10月~2019年12月的52例冠心病死亡案例的冠状动脉作为冠心病组,以同期25例无任何心脏疾病的意外死亡案例作为对照组。通过病理组织学检查冠状动脉管腔狭窄情况和血管内膜斑块形成情况;采用Western blot法检测cTSc和TNF-α的蛋白表达;免疫组织化学染色方法检测cTSc及TNF-α在细胞内的表达及定位。结果:HE染色见对照组冠状动脉内膜光滑平整、无增厚,管腔未见狭窄;冠心病组中血管内膜不规则增厚、粥样硬化斑块形成,中膜明显受压变薄,管腔呈不同程度偏心性狭窄(PcTSc和TNF-α在冠心病组中的表达显著升高(P组织化学染色显示,cTSc和TNF-α均在泡沫细胞胞质中表达,且其阳性表达均显著高于对照组(PcTSc和TNF-α在冠心病中的表达呈正相关(r2=0.743,PcTSc在冠状动脉组织中的表达上调可能促进了TNF-α的表达,从而影响冠心病的发生发展。

关键词：冠心病组织蛋白酶C 肿瘤坏死因子α 动脉粥样硬化

中性粒细胞分泌的组织蛋白酶C对乳腺癌侵袭转移的影响

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中华实验外科杂志 2023年第8期40卷 1550-1553页

作者：赵许囡罗智勇谷宗泽陈卓张哲王芳郑州大学第一附属医院乳腺外科郑州450052 华中科技大学同济医学院附属同济医院甲状腺乳腺外科武汉430032

目的探讨中性粒细胞分泌的组织蛋白酶C对乳腺癌侵袭、转移的影响。方法将MDA-MB-231乳腺癌细胞与中性粒细胞上清液共培养, 以组织蛋白酶C抑制剂(AZD7986)处理共培养细胞24 h, Transwell法检测3组细胞(MDA-MB-231细胞组、共培养组、共培... 详细信息

目的探讨中性粒细胞分泌的组织蛋白酶C对乳腺癌侵袭、转移的影响。方法将MDA-MB-231乳腺癌细胞与中性粒细胞上清液共培养, 以组织蛋白酶C抑制剂(AZD7986)处理共培养细胞24 h, Transwell法检测3组细胞(MDA-MB-231细胞组、共培养组、共培养+AZD7986组)侵袭、迁移能力的变化。蛋白质印迹法(Western blot)检测3组细胞中cTSc、上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达变化。将MDA-MB-231乳腺癌细胞经肠系膜上静脉注射入BALB/c雌性小鼠体内, 随机分为两组, 分别给予口服磷酸盐缓冲液(PBS, 100 μl)(对照组)或AZD7986(5 mg/kg)(实验组), 4周后观察小鼠肝脏成瘤情况。3组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用独立样本t检验。结果 MDA-MB-231细胞组、共培养组、共培养+AZD7986组侵袭细胞数[(67.67±2.52)、(79.67±4.04)、(56.33±3.21)个, F(2, 6)=37.131, PcTSc蛋白水平(0.53±0.03、1.05±0.08、0.75±0.06, F(2, 6)=49.600, P蛋白(E-cadherin)蛋白水平高于共培养组(1.05±0.05比0.58±0.06, t=16.060, P蛋白(N-cadherin)蛋白水平低于共培养组(0.58±0.07比0.83±0.03, t=8.503, P蛋白(Vimentin)蛋白水平低于共培养组(0.52±0.08比0.75±0.05, t=7.866, P蛋白水平低于共培养组(0.66±0.05比0.83±0.05, t=5.997, P蛋白水平低于共培养组(0.30±0.02比0.81±0.02, t=17.390, P组织蛋白酶C的表达, MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭迁移能力明显下降, 小鼠肝脏肿瘤体积明显减小。

关键词：乳腺癌组织蛋白酶C 侵袭转移上皮-间充质转化

新型含噻吩片段的非肽基-非共价组织蛋白酶C抑制剂：设计、合成和抗炎活性评价

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新型含噻吩片段的非肽基-非共价组织蛋白酶C抑制剂：设计、合成和...

作者：张照燕安徽医科大学

学位级别：硕士

组织蛋白酶C(cat c)是一种重要的半胱氨酸蛋白酶,它通过从中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSPs)酶原的N末端切割二肽部分来激活炎症相关的NSPs。NSPs由多形核中性粒细胞(PMN)分泌并作为先天免疫机制的一部分。然而,活性NSPs的过度分泌和活化会... 详细信息

组织蛋白酶C(cat c)是一种重要的半胱氨酸蛋白酶,它通过从中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSPs)酶原的N末端切割二肽部分来激活炎症相关的NSPs。NSPs由多形核中性粒细胞(PMN)分泌并作为先天免疫机制的一部分。然而,活性NSPs的过度分泌和活化会导致组织损伤和炎症。由于NSPs相关炎症性疾病下的器官损伤由多种NSP蛋白酶介导,早期抑制单一NSP并非有效的手段,后面即使开发出靶向多种NSPs的抑制剂也因为多因素叠加影响难以成功。因此,与针对单个NSP的高选择性小分子抑制剂相比,在骨髓中性粒细胞成熟的早幼粒细胞阶段,通过针对靶标cat c来阻断NSPs上游成熟酶,能够更好的抑制NSPs活性水平。然而现有的cat c抑制剂以肽基-共价抑制剂为标准,但亲电“弹头”结构的高反应特性会导致选择性差和随后的脱靶效应,肽基骨架则会带来代谢缺陷。因此,我们希望开发出新一代“非肽基-非共价cat c抑制剂”。本研究基于之前报道的非肽基-非共价cat c抑制剂,以其中的化合物77(Ic=57.2 n M,HLM cL=9.4)为起点,经过基于结构的药物设计和构效关系(SAR)研究,我们得到一种具有独特噻吩结构的新型cat c抑制剂化合物SF38,其对cat c表现出很强的抑制作用(Ic=59.9 n M),具有较好的体外代谢稳定性(HLM cL=6.3)。使用Discovery Studio2018 R2中的cDOcKER模块将化合物SF38与cat c进行对接分析,显示化合物SF38与化合物77结合模式类似,与cat c的S1与S2区域氨基酸残基形成多种相互作用。细胞热位移分析实验表明化合物SF38以浓度依赖性方式提高了靶标cat c蛋白质对温度的耐受性。急性毒性研究发现,在SF38单次给药1500 mg/kg后7天内,未观察到小鼠出现显著的体重减轻或毒性反应。此外,H&E染色也未观察到不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的病理变化,进而进行体内实验。体内药代动力学(PK)研究显示生物利用度(F)达到42.07%。体内评价表明,SF38抑制骨髓和血液中cat c的活性,降低下游NSPs的活化水平。在SF38最高剂量组(50 mg/kg),骨髓和血液中的cat c和NSPs(NE,cat G,PR3)的活性均被抑制至正常组的50%左右。化合物SF38能够以剂量依赖性和时间依赖性方式抑制骨髓和血液中cat c和下游NSPs的活性水平。并且在急性肺损伤(ALI)动物模型中表现出有效的抗炎活性和潜在的保护作用。在SF38治疗组小鼠骨髓和血液中都观察到cat c活性和下游NSP活化的明显剂量依赖性降低,促炎细胞因子的水平显著降低,抗炎细胞因子水平显著增高,呈现剂量依赖性,并且提高了小鼠的存活率。化合物SF38是一种有效的cat c抑制剂,可通过抑制NSPs的激活在体内发挥抗炎活性和潜在的保护作用,用于治疗NSPs相关的炎症疾病。这些研究结果不仅丰富了具有噻吩结构特征的cat c抑制剂的SAR,而且证明了非肽基-非共价cat c抑制剂具有广阔的应用前景。

关键词：组织蛋白酶C 组织蛋白酶C抑制剂炎症性疾病药物设计急性肺损伤

卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）组织蛋白酶C（TrocTSc）参与机体抗菌免疫的研究

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卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）组织蛋白酶C（TroCTSC）参与机体...

作者：刁倩颖海南大学

学位级别：硕士

组织蛋白酶 c(cathepsin c,cTSc),又称作二肽基肽酶 Ⅰ(Dipeptidyl peptidase I,DPPI),是主要存在于溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶,属于番木瓜蛋白酶超家族。它广泛存在于细菌、病毒、原生动物、真菌以及哺乳动物和植物中。cTSc在机体... 详细信息

组织蛋白酶 c(cathepsin c,cTSc),又称作二肽基肽酶 Ⅰ(Dipeptidyl peptidase I,DPPI),是主要存在于溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶,属于番木瓜蛋白酶超家族。它广泛存在于细菌、病毒、原生动物、真菌以及哺乳动物和植物中。cTSc在机体不同组织的生理、病理过程中发挥着非常重要的作用,包括细胞内蛋白质降解、细胞生长、神经氨酸酶激活和血小板因子ⅩⅢ激活等等。近年来陆续开展了水生动物cTSc的研究,发现其在机体抗病免疫反应中发挥重要作用。但是,关于硬骨鱼类cTSc如何参与机体抗细菌免疫的机制尚不清楚。鉴于此,本研究以中国南海主要的深水网箱养殖鱼类卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,克隆并鉴定了卵形鲳鲹组织蛋白酶C(TrocTSc)基因,并对其序列结构及抗菌免疫的功能进行了初步研究。主要实验内容以及结果如下:1.克隆获得了 TrocTSc,其编码区长度为1368 bp,编码455个氨基酸,分子量为50.79 kDa,理论等电点为6.27。氨基酸序列分析表明,N端的第1至第20个氨基酸为信号肽序列;第224至第450个氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的结构域,其中包含3个活性位点,分别为cys251、His397和Asn419。同源性比对结果显示TrocTSc与其他物种cTSc具有较高的同源性,为61.01%～90.77%。其中,与高体鰤同源性最高,高达90.77%;同源性最低的为非洲爪蟾(62.25%);与人(60.93%)和小鼠(61.01%)也有较高的同源性。系统进化树分析结果显示,TrocTSc属于硬骨鱼类的一个分支,与同属于鲹科的高体鰤聚成一个分支,亲缘关系最近。2.通过对TrocTSc在健康条件下和细菌刺激后免疫组织的mRNA水平表达进行实时荧光定量PcR分析,发现TrocTSc在健康卵形鲳鲹的11个组织中均有表达,包括皮肤、心脏、肌肉、胃、脾脏、肠、头肾、鳃、肝脏、脑和血,其中血液的表达量最低,将其设置为1,最高表达量的肌肉组织约为59.2倍,其次是肝脏约为33.5倍。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染卵形鲳鲹后,TrocTSc在脾脏、头肾和肝脏中的表达显著上调,其中在感染9 h后肝脏和头肾的表达量达到峰值,脾脏的表达量在感染12 h后达到峰值。说明TrocTSc广泛存在于卵形鲳鲹的各种组织中,在免疫器官中的高表达,提示TrocTSc可能参与机体的抗菌免疫反应。3.为了研究TrocTSc参与机体抗细菌免疫的机制,首先对TrocTSc在细胞中的定位进行了分析。结果显示,在卵形鲳鲹吻细胞(GPS)中TrocTSc主要分布在细胞质,部分存在于细胞质的溶酶体中。进一步研究发现,哈维氏弧菌刺激可促使TrocTSc从细胞质迁移至细胞核,表明细菌刺激可激活TrocTSc发生核易位,从而发挥其功能。4.基于TrocTSc活性位点的分析,成功构建了针对其保守催化活性位点的三个突变体,并诱导表达了 TrocTSc以及三个突变体的的融合蛋白rTrocTSc、rTrocTSc-c251A、rTrocTSc-H397A 和 rTrocTSc-N419A。体外酶活实验使用 cTSc特异性底物(Gly-Phe-β-naphthylamide),结果表明,rTrocTSc的最适pH和温度分别为5.5和40℃。金属离子毒性实验表明,ca2+、Zn2+能够明显促进rTrocTSc的酶活性,Fe2+和cu2+能抑制rTrocTSc的酶活性,而Mn2+和Mg2+对rTrocTSc酶活性没有显著抑制或促进作用。与rTrocTSc相比,rTrocTSc-c251A、rTrocTSc-H397A和rTrocTSc-N419A的活性显著降低,表明该活性位点对TrocTSc发挥功能至关重要。5.运用活体实验进一步分析了 TrocTSc参与机体抗细菌免疫的效应。结果表明,当鱼体过量表达TrocTSc后感染哈维氏弧菌,过量表达组在脾脏、头肾和肝脏组织中细菌的数量显著低于对照组,显著提高了机体的抗菌能力。与此相一致的是,当鱼体中干扰表达TrocTSc后,干扰表达组在脾脏、头肾和肝脏组织中细菌的数量显著高与对照组。对免疫相关基因表达研究还发现,TrocTSc过量表达可显著上调各种促炎症细胞因子的mRNA水平,包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8,说明TrocTSc可增强机体的抗细菌感染能力。综上所述,本研究克隆并鉴定了卵形鲳鲹TrocTSc,并对其抗细菌免疫进行了研究。结果表明TrocTSc在宿主调节炎症反应、抵抗细菌感染和增强抗菌免疫反应的能力方面具有非常关键的作用,三个活性位点cys251、His397和Asn419影响TrocTSc酶活。研究结果对进一步了解卵形鲳鲹抗病机制具有重要意义,也为卵形鲳鲹养殖业的绿色健康可持续发展提供了理论基础。

关键词：组织蛋白酶C 卵形鲳鲹哈维氏弧菌抗菌免疫

掌跖角化-牙周破坏综合征个案患者家系组织蛋白酶C的基因突变分析

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华西口腔医学杂志 2016年第4期34卷 346-349页

作者：陈远娇李晨军成都军区总医院口腔科成都610017

目的通过研究一例掌跖角化-牙周破坏综合征(PLS)患者及其家系组织蛋白酶C(cTSc)基因突变的特点,提供PLS分子致病机制的理论依据,丰富PLS基因诊断和治疗的科学资料。方法取得临床发现的一例PLS先证者及其家属知情同意,分别提取先证者及... 详细信息

目的通过研究一例掌跖角化-牙周破坏综合征(PLS)患者及其家系组织蛋白酶C(cTSc)基因突变的特点,提供PLS分子致病机制的理论依据,丰富PLS基因诊断和治疗的科学资料。方法取得临床发现的一例PLS先证者及其家属知情同意,分别提取先证者及其父母、姐姐的基因组DNA,应用聚合酶链反应和DNA直接测序技术,分析先证者及其直系血亲cTSc基因的突变情况。结果 PLS先证者cTSc基因存在复合型杂合突变,突变位点是c.754c>T和c.1040A>G,其父母均为携带者,姐姐未发现突变。结论 PLS先证者的临床表征是由cTSc基因突变引起。

关键词：组织蛋白酶C 掌跖角化-牙周破坏综合征基因突变

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组织蛋白酶C在鼠、人组织中的表达研究

组织蛋白酶C在鼠、人组织中的表达研究

作者：胡鑫第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】组织蛋白酶是广泛存在于多种组织细胞溶酶体内的一类蛋白水解酶,在机体各种生理活动中发挥重要作用。组织蛋白酶种类较多,并具有一定的组织特异性,不同的细胞,甚至是同一种细胞处于不同的生理环境所表达的蛋白酶都不同。根据催... 详细信息

【背景】组织蛋白酶是广泛存在于多种组织细胞溶酶体内的一类蛋白水解酶,在机体各种生理活动中发挥重要作用。组织蛋白酶种类较多,并具有一定的组织特异性,不同的细胞,甚至是同一种细胞处于不同的生理环境所表达的蛋白酶都不同。根据催化中心的不同,组织蛋白酶可分为三类:丝氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶A和G),半胱氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶B、c、L、H、S等),和天冬氨酸组织蛋白酶(组织蛋白酶D和E)。迄今为止,虽然人们已经发现了共10余种组织蛋白酶,但有关其生理功能的了解还远远不够。组织蛋白酶C(cathepsin c,cat c),即为其中的一种。组织蛋白酶C又称二肽基肽酶I(DPPI),该酶发现于十九世纪40年代,是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶,已有的研究表明,该酶在炎症细胞中表达水平较高,可能与颗粒酶的激活有关。除此之外,虽然检测到该酶在多种组织中均广泛表达,但表达情况与功能尚不明确。1999年Toomes等人通过基因检测手段证实,组织蛋白酶C基因(cTSc)突变可引发一种遗传性疾病--掌跖角化综合征(PLS),其典型临床症状为早发型牙周炎并伴有皮肤过度角化,和/或化脓性皮炎,肝、肺脓肿等,从而引发人们对该蛋白酶的关注。该病由法国人Papillon和Lefèvre于1924年首次报告,患病率约为百万分之一到四。迄今为止,不同的研究在PLS患者体内发现多个组织蛋白酶C突变位点,并在多种以早发性牙周炎和/或伴有皮肤过角化为表现的疾病中,如Haim—Munk综合征(HMS)和青春期前牙周炎(PP)中都发现了组织蛋白酶C的基因突变。临床发现,这类疾病的病变主要集中于机体内、外表层器官或组织——牙龈和皮肤,于是我们推测,组织蛋白酶C可能与上皮细胞功能密切相关,该酶的基因突变很可能导致上皮组织的生理功能受到严重影响,从而使牙龈和皮肤局部的防御能力下降,进一步导致疾病的发生。为了证实我们的猜测,在本研究中我们以小鼠多种健康器官的上皮组织、创伤或感染的皮肤,以及人慢性牙周炎牙龈组织、多种口腔黏膜病组织为研究对象,观察了组织蛋白酶C在其中的表达变化,为深入研究组织蛋白酶C的生物学功能提供形态学依据。另外,为了初步探讨组织蛋白酶C的变化与上皮细胞免疫功能变化之间的关系,我们还检测了部分组织中,与上皮细胞免疫密切相关的Toll样受体4的表达变化,以期为进一步深入研究提供参考。【目的】研究健康小鼠多种器官上皮组织中组织蛋白酶C的表达,小鼠皮肤创伤\感染模型中组织蛋白酶C的表达,以及人类牙周病和多种黏膜病组织中组织蛋白酶C和TLR4的表达。【方法】1、小鼠正常生理状态下多种器官上皮组织中组织蛋白酶C的表达研究取c57小鼠肝脏、肺、小肠、膀胱、颊黏膜、牙龈、脚掌皮肤和背部皮肤组织,进行组织蛋白酶C免疫组化染色观察。2、小鼠皮肤创伤/感染状态下组织蛋白酶C的表达变化c57小鼠随机分为3大组(对照组和两个实验组),两实验组分别再随机分为3小组:即健康对照组,12h、24h、48h单纯创伤组,12h、24h、48h创伤合并感染组。单纯创伤组和创伤合并感染组分别在小鼠脚掌皮肤做创伤及创伤合并感染处理,分别于各时间点取材。进行HE染色和组织蛋白酶C免疫组化染色观察。3、人牙周病、多种黏膜病组织中组织蛋白酶C和TLR4的表达研究取人类慢性牙周炎、口腔扁平苔藓、盘状红斑狼疮、白斑和鳞癌组织标本,进行组织蛋白酶C、Toll样受体4(TLR4)免疫组化染色观察。【结果】1、小鼠组织蛋白酶C在肝脏、肺、小肠、膀胱上皮组织中均有较强表达,而颊黏膜、牙龈黏膜、脚掌皮肤及背部皮肤上皮中的表达较弱或不表达。2、HE染色结果显示小鼠皮肤创伤/感染模型建造成功。免疫组化染色结果显示:健康对照组小鼠皮肤组织蛋白酶C表达不明显,而单纯创伤组和创伤合并感染组三个时间点皮肤的上皮和结缔组织中均有组织蛋白酶C染色,染色主要集中在上皮的基底层和棘层细胞,以及结缔组织的炎性细胞中。另外,两个实验组内组织蛋白酶C染色强度随实验时间的增加而呈增强趋势,且创伤合并感染组染色强度略高于单纯创伤组。3、组织蛋白酶C在慢性牙周炎、口腔扁平苔藓、盘状狼疮、白斑和鳞癌组织中均有不同强度的表达,主要表达在上皮的角化层和棘层,以及结缔组织的炎性细胞中;部分标本TLR4表达情况与组织蛋白酶C相似。【结论】1、组织蛋白酶C在小鼠不同器官上皮中的表达各异,推测其在维护上皮细胞正常生理功能方面具有一定的作用。2、组织蛋白酶C在创伤/感染小鼠皮肤结缔组织和上皮中表达上调,提示其与皮肤上皮的创面愈合和炎症反应有密切的关系,可能参与上皮细胞的增殖和分化、及局部免疫防御。3、在处于不同免疫微环境的疾病组织中,组织蛋白酶C的表达主要集中在固有免疫、自身免疫及异常增生情况下的上皮细胞和免疫炎性细胞中,与TLR4的表达有一定相似性,提示组织蛋白酶C可能与上皮细胞免疫功能的发挥有一定关系。

关键词：组织蛋白酶C cathepsin c cTSc DPPI TLR4 免疫

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组织蛋白酶C在牙周炎症反应中的功能初探

组织蛋白酶C在牙周炎症反应中的功能初探

作者：王津津第四军医大学

学位级别：硕士

掌跖角化-牙周破坏综合征(Papillon-Lefèvre syndrome,PLS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,严重的早发性牙周炎是其主要的临床表现之一。患者通常在乳牙期即发病,炎症一直持续至恒牙期,最终可导致牙齿脱落。多数患者还可同时伴有掌跖... 详细信息

掌跖角化-牙周破坏综合征(Papillon-Lefèvre syndrome,PLS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,严重的早发性牙周炎是其主要的临床表现之一。患者通常在乳牙期即发病,炎症一直持续至恒牙期,最终可导致牙齿脱落。多数患者还可同时伴有掌跖、膝盖等部位皮肤的角化异常。目前研究已经证实,组织蛋白酶C基因(cathepsin c gene,cTSc)突变是PLS的致病基础,但是具体机制尚不清楚。组织蛋白酶C,又称二肽肽酶I(Dipeptidyl peptidase I,DPPI)是一类溶酶体半胱氨酸蛋白酶,参与机体细胞内蛋白质的降解。现有的研究表明,组织蛋白酶C对激活杀伤性T细胞(又称细胞毒性T淋巴细胞,cytotoxic T lymphocyte,cTL)中粒酶A和粒酶B,从而使cTL发挥正常的免疫功能有重要作用,因此cTSc突变导致的组织蛋白酶C异常表达可能会导致机体抗感染能力减弱,从而引发和加重炎症反应。但是,关于组织蛋白酶C表达异常所造成的PLS临床病损为何会主要集中在牙周组织的破坏以及多部位上皮的角化异常,其原因和机制目前尚无合理解释。探究组织蛋白酶C在牙周炎症反应中的功用,对于明确PLS的发病及牙周组织的自我保护机制具有重要意义。研究目的:1.观察不同状态下牙龈上皮细胞中组织蛋白酶C的表达差异,初步探讨其与上皮细胞分化、免疫功能的关系;2.通过基因敲除小鼠探讨cTSc缺失对牙周组织炎症反应的影响,进一步明确组织蛋白酶C在牙周组织炎症反应中可能承担的角色。研究方法:1.探究不同状态下牙龈组织中组织蛋白酶C表达变化:采用Real-time PcR方法检测并比较健康牙龈、牙龈炎牙龈以及牙周炎牙龈组织中cTSc基因表达的差异;采用免疫组织化学法检测并比较上述3种状态下组织蛋白酶C表达的差异。2.探究牙龈上皮组织中组织蛋白酶C表达变化与上皮细胞分化的关系:利用免疫组化染色观察比较人健康牙龈、牙龈炎牙龈以及牙周炎牙龈的上皮分化相关指标cK10、cK19的表达情况并分析其与相同状态下组织蛋白酶C表达的相关性。3.探究牙龈上皮组织中组织蛋白酶C的表达变化与上皮细胞免疫的关系:利用免疫组化染色观察比较人健康牙龈、牙龈炎牙龈以及牙周炎牙龈的Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)的表达情况并分析其与相同状态下组织蛋白酶C表达的相关性。4.建立小鼠牙周炎模型并观察牙周炎症反应:采用向cTSc基因敲除c57小鼠和野生型c57小鼠的牙周组织局部注射大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的方法建立小鼠切牙牙周炎模型及磨牙牙周炎模型。Micro-cT扫描,进行切牙区牙槽骨体积以及磨牙区牙槽骨高度的变化量分析;HE染色观察比较cTSc基因敲除鼠和野生型鼠牙周组织的炎症水平,并进行差异分析。研究结果:1.Real-time PcR结果显示:牙龈炎和牙周炎状态下牙龈组织中cTSc的表达量显著高于健康状态下牙龈组织中cTSc表达量;牙龈炎和牙周炎组织中cTSc基因的表达量未见明显差异。免疫组化结果显示:健康状态下,组织蛋白酶C在牙龈上皮中仅有散在地少量表达,而牙龈炎和牙周炎状态下牙龈组织中组织蛋白酶C的表达阳性率明显增加,且表达位置主要位于牙龈上皮的基底上层,尤其是上皮表层表达最强,结缔组织内几乎没有组织蛋白酶C表达;牙龈炎和牙周炎组组织蛋白酶C阳性表达细胞比例及表达强度无显著差异。2.免疫组化结果显示:在牙周发生炎症反应时,伴随cTSc表达增高的同时,上皮细胞的分化发生了改变,cK19在基底上层出现散在的表达,cK10的表达则明显增加,且与cTSc表达变化趋势同步,提示组织蛋白酶C可能与上皮分化功能的改变有关。3.免疫组化结果显示:与cTSc的变化趋势类似,在牙周炎症时,TLR4在牙龈上皮的表达明显增加,且主要集中于上皮表层位置,提示组织蛋白酶C可能与上皮免疫功能的发挥存在一定关系。4.对cTSc基因敲除鼠和野生型鼠建模后,通过比较小鼠切牙区实验前后及磨牙区实验侧和对照侧牙槽骨的骨量及高度,结果令人惊讶。与人类不同,野生型鼠相比建模前,牙槽骨骨量及高度均发生了明显的降低,而cTSc基因敲除鼠未见明显变化。HE染色结果显示:野生型鼠牙周组织中有大量的炎性细胞浸润,并且牙槽骨以及牙周膜纤维的破坏程度也明显高于cTSc基因敲除鼠。免疫组化结果显示:野生型鼠牙周组织中表达NF-κB的细胞数明显多于cTSc基因敲除鼠。故,组织蛋白酶C缺失在小鼠牙周发生炎症时,反而对牙周组织产生一种“保护”作用。通过进一步的免疫组化染色发现,cTSc在人类和鼠的牙周组织中表达模式存在差异,人牙龈上皮的组织蛋白酶C主要表达于基底上层,尤其是近表皮层;而在鼠牙龈组织中,组织蛋白酶C主要表达于上皮的基底层以及临近基底的部分基底上层,表皮层未见明显表达,这可能与cTSc

关键词：组织蛋白酶C 炎症牙周组织分化免疫小鼠