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组氨酸标签蛋白纯化介质——EDTA-壳聚糖的制备与应用

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中国食品学报 2018年第12期18卷 144-149页

作者：邵明聪华伟伟邱金丹黄建颖浙江工商大学食品与生物工程学院杭州310018

以离子液体为溶剂,溶解具有较强金属螯合能力的EDTA-壳聚糖,能够保持较强的稳定性。将其用于涂膜处理,螯合两种金属离子(Ni2+,Zn2+),形成M2+-EDTA-壳聚糖(M=Ni,Zn),并对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化。结果表明:EDTA-壳聚糖经过涂... 详细信息

以离子液体为溶剂,溶解具有较强金属螯合能力的EDTA-壳聚糖,能够保持较强的稳定性。将其用于涂膜处理,螯合两种金属离子(Ni2+,Zn2+),形成M2+-EDTA-壳聚糖(M=Ni,Zn),并对组氨酸标签蛋白进行特异性亲和纯化。结果表明:EDTA-壳聚糖经过涂膜处理后,形成坚韧而富有弹性的膜,用于组氨酸蛋白分离取得良好的效果,相比直接用于EGFP-(His)6-NH2蛋白纯化分离表现很大的优势,得到目的蛋白的纯度约为95%,与涂膜前相比,缩短了10 min的分离时间,且能更好地特异性吸附目的蛋白,在一定程度上节约了时间和成本。

关键词：离子液体 EDTA-壳聚糖组氨酸标签分离纯化

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组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定

作者：陈丰中南民族大学

学位级别：硕士

半纤维素(hemicollulose)与纤维素、木质素共同组成植物细胞壁的三大主要成分,木聚糖是半纤维素中的最主要成分。木聚糖酶(endo-1,4-xylanase,EC 3.***.1.8)是糖苷水解酶家族的成员,可以水解纤维素的主要成分——木聚糖。近几十年来,木聚... 详细信息

半纤维素(hemicollulose)与纤维素、木质素共同组成植物细胞壁的三大主要成分,木聚糖是半纤维素中的最主要成分。木聚糖酶(endo-1,4-xylanase,EC 3.***.1.8)是糖苷水解酶家族的成员,可以水解纤维素的主要成分——木聚糖。近几十年来,木聚糖酶广泛应用在工业生产中,包括纺织、食品、饲料、造纸和纸浆工业。同时有研究报道,这类酶在生物降解和生物转化农业废弃物和副产品方面有广阔的前景。根据氨基酸序列的相似程度以及核心催化区域的结构特点,木聚糖酶被分入糖苷水解酶第10和第11家族。第11家族木聚糖酶具有较小的分子质量,在结构上高度相似,并且有相似的木聚糖底物特异性。11家族耐热木聚糖1YNA分离自嗜热真菌Thermomyces lanuginosus DSM10635,在Escherichia ***21(DE3)中表达。为提高其稳定性,利用PCR手段,在其N末端添加了一个二硫键Q1C-Q24C。得到重组酶DSB在pH 6.5环境下最适反应温度提高了10°C,达到了75°C。为简化DSB纯化方式,本研究以木聚糖酶DSB基因为模板,利用PCR去除其终止密码子后插入表达载体pET-22b(+),得到C末端添加多聚组氨酸标签(His·Tag)的木聚糖酶表达载体,构建基因命名为dsb-his,并利用大肠杆菌表达。表达产物经Ni Sepharose亲和层析纯化,得到电泳纯的酶。酶蛋白的大小,酶特性没有受到组氨酸标签的影响。蛋白纯化操作得到了简化。虽然组氨酸标签在蛋白纯化方面应用广泛,其对酶特性的影响还没有系统的研究和总结。结合11家族木聚糖酶的3D结构分析,分析是因为C末端在酶蛋白表面且组氨酸标签较小,形成无规则卷曲。本研究说明组氨酸标签木聚糖酶的生化特性和原始酶没有差异,提供了高效纯化相应木聚糖酶的方法,为相关小分子酶蛋白的纯化提供了更简便的操作途径。

关键词：耐热木聚糖酶组氨酸标签 Ni亲和层析蛋白纯化

栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响

同方学位论文库评论

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同方学位论文库

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食品科学 2014年第21期35卷 143-148页

作者：刘英丽刘骏明王静孙宝国 THIERRY Tron 北京工商大学食品质量与安全北京实验室北京市食品添加剂工程技术研究中心北京100048 Aix Marseille Université CNRSiSm2 UMR 7313Marseille France 13397

以来源Trametes sp.C30的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性... 详细信息

以来源Trametes sp.C30的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响,但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面,与LAC3相比,N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强,中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。

关键词：漆酶异源表达组氨酸标签碳端氮端

应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库

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中国生物化学与分子生物学报 2013年第5期29卷 475-481页

作者：董晓民钟理樊江平张旭朏河北大学生命科学学院生物芯片研究室保定071002 Western University of Health Sciences California 91766 USA

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位... 详细信息

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3'端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库.经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定.结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6%提高至70%,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法.

关键词：组氨酸标签 T7噬菌体展示文库开放阅读框

带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

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中国预防兽医学报 2005年第3期27卷 193-195页

作者：温建新仇华吉涂亚斌王柳彭金美童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题。本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入Nsp... 详细信息

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题。本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266_HIS。将pOK8266_HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子。提取pOK8266_HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础。本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制。

关键词：马传染性贫血病毒感染性分子克隆组氨酸标签马传染性贫血 S2基因

一种带有组氨酸标签的抗糖尿病疫苗的构建、表达、纯化及鉴定

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药物生物技术 2013年第3期20卷 189-193页

作者：杨雪刘晓锐邢芸徐茂磊金亮刘景晶吴洁中国药科大学生命科学与技术学院微基因实验室江苏南京210009

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277... 详细信息

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277。通过乳糖诱导,融合蛋白HIS-HSP65-6P277在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中以可溶形式表达,镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明表达产物是约70 k具有6个组氨酸标签肽的融合蛋白;分离纯化融合蛋白的时间从原来的15～20 d缩短为2～3 d,产量提高到56 mg/L。组氨酸标签系统可以较好的简化抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的纯化工艺,提高产量。

关键词：疫苗 Ⅰ型糖尿病大肠杆菌重组表达 His-Hsp65-6p277融合蛋白分离纯化组氨酸标签

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抗组氨酸标签单克隆抗体的制备、鉴定及应用

重庆医学 2013年第32期42卷 3918-3920页

作者：戚大梁王强易维京解放军第八二医院一四九临床部江苏连云港222042

目的制备特异性抗组氨酸标签(His-tag)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以合成的15个组氨酸的多肽耦联牛血清清蛋白(BSA)为抗原免疫Balb/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性克隆及有限稀释法进... 详细信息

目的制备特异性抗组氨酸标签(His-tag)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以合成的15个组氨酸的多肽耦联牛血清清蛋白(BSA)为抗原免疫Balb/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性克隆及有限稀释法进行克隆化,用Protein G柱亲和纯化抗体及ELISA检测纯化抗体的效价、相对亲和力及抗体亚类,用ELISA及Western blotting对mAb的特异性进行鉴定,并与含His-tag的重组蛋白特异性抗体配对建立双抗夹心ELISA定量检测对应的重组蛋白。结果筛选出5株能稳定分泌抗His-tag的杂交瘤细胞株,抗体亚类均为IgG1(κ),其中1-G2亲和力最高(1.27×1010),并且1-G2在ELISA及Western blotting中能与不同类型的含His-tag的重组蛋白结合,能与降钙素原(PCT)抗体构建双抗夹心ELISA定量检测含His-tag的PCT重组蛋白,灵敏度达到4.6ng/mL。结论成功制备了特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗His-tag的mAb,该抗体能应用于ELISA及Western blotting等多种His-tag的检测方法,为蛋白质研究检测、定位、相互作用等提供了工具。

关键词：抗体单克隆酶联免疫吸附测定印迹法蛋白质组氨酸标签

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铁镍磁性微球直接纯化组氨酸标签蛋白

化学研究与应用 2015年第10期27卷 1569-1573页

作者：刘宝全张停停鲍丽吕晓菊王佳宁张艳梅王剑锋范圣第大连民族大学生命科学学院生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室辽宁大连116600

以氯化铁与硫酸镍为主要原料基于热分解法原理一锅法合成铁镍磁性微球。氯化铁、硫酸镍和乙酸钠在(80℃)乙二醇中搅拌30 min,在氮气保护下,加入乙醇胺后180℃搅拌6h,经过水清洗与乙醇清洗后获得有磁性的含镍微球,XRD检测结果证实晶型为N... 详细信息

以氯化铁与硫酸镍为主要原料基于热分解法原理一锅法合成铁镍磁性微球。氯化铁、硫酸镍和乙酸钠在(80℃)乙二醇中搅拌30 min,在氮气保护下,加入乙醇胺后180℃搅拌6h,经过水清洗与乙醇清洗后获得有磁性的含镍微球,XRD检测结果证实晶型为Ni Fe2O4,晶体的平均粒径为6.75 nm。磁性微球不经任何修饰直接与组氨酸标签蛋白结合,完成带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白纯化,SDS-PAGE检测结果表明:使用5倍于镍配位凝胶质量的铁镍磁性微球可达到与镍配位凝胶相近的蛋白质吸附量。低成本的铁镍磁性微球可以替代镍配位凝胶用于组氨酸标签蛋白的分离纯化。

关键词：铁镍磁性微球热分解法组氨酸标签蛋白纯化

含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达

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安徽农业大学学报 2006年第4期33卷 496-498页

作者：朱娟范军朱苏文程备久安徽农业大学生命科学学院合肥230036

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB。将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28 a中构建成表达载体。表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签。构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在I... 详细信息

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB。将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28 a中构建成表达载体。表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签。构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为337 ***-1,表明组氨酸标签不显著影响酶活。

关键词： 5-氨基酮戊酸脱水酶枯草杆菌高效表达组氨酸标签