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粉尘螨诱导结膜上皮细胞损伤促进中性粒细胞迁移与中性粒细胞胞外陷阱形成

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中国血吸虫病防治杂志 2023年第3期35卷 271-278页

作者：吴美丽闫茹赵文君南京医科大学附属无锡人民医院临床研究中心江苏无锡214023 江南大学附属儿童医院儿科实验室南京医科大学附属无锡人民医院检验科江苏无锡214023

目的探讨粉尘螨粗提浸液刺激人结膜上皮细胞损伤及诱导中性粒细胞迁移和中性粒细胞胞外陷阱(neutro⁃phil extracellular traps,NETs)形成,从而引起过敏性结膜炎的发病机制。方法采用500、1000、2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液刺激人结... 详细信息

目的探讨粉尘螨粗提浸液刺激人结膜上皮细胞损伤及诱导中性粒细胞迁移和中性粒细胞胞外陷阱(neutro⁃phil extracellular traps,NETs)形成,从而引起过敏性结膜炎的发病机制。方法采用500、1000、2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液刺激人结膜上皮细胞,采用实时荧光定量PCR(quantitative real⁃time PCR,qPCR)和酶联免疫吸附试验(en⁃zyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA)检测人结膜上皮细胞中白细胞介素6(interleukin⁃6,IL⁃6)、肿瘤坏死因子α(tu⁃mor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)、γ干扰素(interferon⁃γ,IFN⁃γ)和IL⁃8表达水平。收集人结膜上皮细胞培养上清液,与中性粒细胞共培养,采用Transwell细胞迁移实验检测中性粒细胞迁移数量,采用免疫荧光染色检测NETs标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,CitH3)表达。采用佛波酯(phorbol 12⁃myristate 13⁃acetate,PMA)刺激中性粒细胞并收集NETs,应用NETs处理人结膜上皮细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用ELISA法检测细胞培养上清中IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ和IL⁃8水平。结果2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液处理上调人结膜上皮细胞中IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ和IL⁃8表达水平;经2000、4000 ng/mL粉尘螨粗提浸液处理后,人结膜上皮细胞培养上清可促进中性粒细胞迁移,诱导MPO和CitH3染色丝状物增加;增加的NETs进一步诱导人结膜上皮细胞凋亡和IL⁃6、TNF⁃α、IFN⁃γ和IL⁃8释放。结论粉尘螨粗提浸液诱导人结膜上皮细胞损伤,从而促进中性粒细胞迁移与NETs形成,而NETs释放进一步加剧人结膜上皮细胞损伤。

关键词：粉尘螨过敏性结膜炎人结膜上皮细胞中性粒细胞中性粒细胞胞外陷阱

粉尘螨谷氧还蛋白-1样蛋白基因原核表达质粒的构建及结构分析

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中国病原生物学杂志 2023年第6期18卷 672-676,682页

作者：任雅宁周鹰袁存银周冬梅廖媛芬强士豪罗金丹崔玉宝南京医科大学附属无锡人民医院临床研究中心江苏无锡214023 南京医科大学附属儿童医院儿科实验室

目的获得粉尘螨谷氧还蛋白-1样蛋白(Glutaredoxin-1,Grx1)的编码基因并构建表达质粒,对该基因及其编码蛋白质进行结构预测。方法以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得编码基因后插入原核表达载体pET28a(+),构建的重组质粒转化入E.coil BL... 详细信息

目的获得粉尘螨谷氧还蛋白-1样蛋白(Glutaredoxin-1,Grx1)的编码基因并构建表达质粒,对该基因及其编码蛋白质进行结构预测。方法以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得编码基因后插入原核表达载体pET28a(+),构建的重组质粒转化入E.coil BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-Dthiogalactoside,IPTG)诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。采用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的结构等生物学特征。结果获得的粉尘螨Grx1编码基因全长315bp,构建的原核表达质粒pET28a(+)-Grx1转化入大肠埃希菌感受态细胞后经IPTG诱导,表达相对分子质量为25.9×10^(3)的重组蛋白。生物信息学分析该基因编码的蛋白质由104个氨基酸组成,主要分布于细胞核(占87.0%)。该蛋白含有11个潜在磷酸化位点(4个苏氨酸,6个丝氨酸和1个酪氨酸),二级结构为α-螺旋(45.19%)、无规则卷曲(31.73%)、延伸链(14.42%)和β-转角(8.65%)。将该基因推导出的编码氨基酸序列进行Blast获得同源基因与屋尘螨谷胱甘肽样C8样蛋白(Dermatophagoides pteronyssinus glutaredoxin-C8-like)同源性最高(83.52%)。结论获得了粉尘螨Grx1的编码基因及其原核表达质粒,生物信息学分析该蛋白含有潜在的磷酸化位点且主要分布于细胞核,可为该基因的生理功能研究及粉尘螨的防制提供参考。

关键词：粉尘螨谷氧还蛋白-1样蛋白生物信息学基因克隆

粉尘螨瘦素受体叠加转录蛋白样1基因克隆及序列分析

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中国血吸虫病防治杂志 2020年第3期32卷 248-254页

作者：杨华莹朱晗婷崔玉宝南京医科大学附属无锡人民医院无锡214023

目的获得粉尘螨瘦素受体叠加转录蛋白样1(Leptin receptor overlapping transcript-like 1,LepROTL1)的编码基因及其分子特征,并构建表达质粒。方法根据转录组测序结果,获得粉尘螨LepROTL1编码基因序列片段。据此设计引物,应用实时PCR... 详细信息

目的获得粉尘螨瘦素受体叠加转录蛋白样1(Leptin receptor overlapping transcript-like 1,LepROTL1)的编码基因及其分子特征,并构建表达质粒。方法根据转录组测序结果,获得粉尘螨LepROTL1编码基因序列片段。据此设计引物,应用实时PCR技术从粉尘螨总RNA中扩增全长基因片段,构建原核表达质粒pET28a(+)-LepROTL1后测序。将该质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)T1R,异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blotting)鉴定表达产物。采用生物信息学软件分析该序列及其编码的蛋白质分子特征。结果 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示1个清晰条带;构建的质粒pET28a(+)-LepROTL1经测序显示,该编码基因从起始密码子ATG至终止密码子TAA共417 bp,该质粒转化大肠埃希菌后经IPTG诱导,SDS-PAGE见特异性条带,提示有表达。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白质由134个氨基酸组成,相对分子质量为14 378.13 Da,其亲水性指数为1.149,有一定疏水性;二级结构包括α-螺旋(19 aa,14.18%)、延伸主链(48 aa,35.82%)和无规卷曲(67 aa,50.00%)。将该基因推导出的氨基酸序列进行BLAST获得同源基因,构建的系统进化树中粉尘螨与屋尘螨聚成一簇。结论本研究获得了粉尘螨LepROTL1编码基因全长及其表达质粒,通过生物信息学分析获得其分子特征,为进一步研究该基因奠定了基础。

关键词：瘦素受体叠加转录蛋白样1 尘螨粉尘螨基因克隆

粉尘螨过敏原Der f 35的克隆表达及免疫学鉴定

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深圳大学学报（理工版） 2021年第3期38卷 301-306页

作者：陈扬陈献雄欧阳春艳钟永浩刘晓宇深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳大学医学部广东深圳518060

粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根... 详细信息

粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根据已知基因序列(GenBank:LC175222.1)设计引物进行反转录聚合酶链式反应扩增,经Bam H I和Xho I双酶切,连接构建pET-32a-Der f 35载体,并克隆至大肠杆菌TOP 10菌株,取1 mL克隆菌液进行测序.使用试剂盒提取高纯度质粒转至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导、表达纯化及免疫学鉴定,并进行同源性比对分析、进化树构建及二级结构预测.克隆和表达结果显示,Der f 35基因的片段长约436个碱基对(base pair,bp);重组蛋白Der f 35相对分子质量约为30 ku(1 u=1 D),与预期结果相符.蛋白质印迹法结果证明,Der f 35与尘螨过敏性疾病患者的血清结合有明显的反应原性.生物信息学进化树结果显示,粉尘螨与屋尘螨、热带无爪螨、害嗜鳞螨、绵羊痒螨和免耳痒螨亲缘关系较近,二级结构预测显示Der f 35的氨基酸序列由2个α螺旋、6个β折叠、2个β转角和10个无规则卷曲片段组成.研究结果可为尘螨过敏性疾病的诊断与治疗提供理论依据.

关键词：生物信息学免疫学粉尘螨过敏原Der f 35 克隆表达过敏原性鉴定

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基于高通量测序的粉尘螨体内细菌多样性研究

中国血吸虫病防治杂志 2022年第6期34卷 630-634页

作者：周小倩马杰王睿怡王若航吴毅强杨欣宴陈玉娟唐小牛孙恩涛皖南医学院医学寄生虫学教研室安徽芜湖241002 皖南医学院卫生检验与检疫学教研室安徽芜湖241002 皖南医学院公共卫生学院环境卫生学与职业卫生学教研室

目的探讨粉尘螨(Dermatophagoides farinae)体内细菌多样性。方法取实验室人工饲养的粉尘螨,采用Illumina PE250高通量测序平台扩增测序细菌16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因V4区,获得的原始序列经质控过滤后得到有效序列... 详细信息

目的探讨粉尘螨(Dermatophagoides farinae)体内细菌多样性。方法取实验室人工饲养的粉尘螨,采用Illumina PE250高通量测序平台扩增测序细菌16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因V4区,获得的原始序列经质控过滤后得到有效序列。采用Usearch软件、Silva数据库、Mothur软件对有效序列进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类并分析细菌群落组成与alpha多样性指数。结果共获得187616条有效序列,根据序列相似性>97%进行聚类,得到469个OTUs。OTU注释结果表明,粉尘螨体内细菌分属于26个门、43个纲、100个目、167个科、284个属。在门分类阶元水平,粉尘螨体内细菌主要注释到变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门,其中变形菌门为优势菌门;在属分类阶元水平,罗尔斯通氏菌属、立克次体目未确定属、葡萄球菌属和鞘氨醇单胞菌属为优势菌属。在非优势菌属中,发现沃尔巴克氏体。结论粉尘螨体内细菌群落组成具有较高多样性,个体间细菌群落多样性与丰度存在差异。

关键词：粉尘螨细菌多样性 16S核糖体RNA 高通量测序

2,4-二硝基氟苯和粉尘螨诱导的特应性皮炎样小鼠模型皮损中固有淋巴样细胞的变化

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免疫学杂志 2022年第12期38卷 1038-1045页

作者：冯树晶王宇高翠娥刘文英宋志强陆军军医大学西南医院皮肤科重庆400038 陆军军医大学高原军事医学系病理生理学教研室重庆400038 西南大学医学研究院重庆400715

目的本研究以半抗原和过敏原建立特应性皮炎(AD)样小鼠模型,并初步观察固有淋巴样细胞的数量和表面标志。方法将2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)和粉尘螨(dermatophagoides farina, DfE)提取物交替涂擦于Balb/c小鼠... 详细信息

目的本研究以半抗原和过敏原建立特应性皮炎(AD)样小鼠模型,并初步观察固有淋巴样细胞的数量和表面标志。方法将2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)和粉尘螨(dermatophagoides farina, DfE)提取物交替涂擦于Balb/c小鼠的背部皮肤8周。记录小鼠皮损临床特征,观察固有淋巴样细胞的变化。结果致敏小鼠背部出现严重的红斑、糜烂和表皮剥落,Th2型免疫反应因子在皮损中升高,具有典型特应性皮炎临床特征。模型组皮损中总固有淋巴样细胞数量显著升高,分泌IL-10的类调节型固有淋巴细胞数量显著降低。II型固有淋巴细胞(typy two innate lymphoid cells, ILC2s)在模型小鼠皮肤中数量显著升高,激活的ILC2细胞数量增多。在模型组与对照组小鼠脾中,ILC2细胞数量、激活标志以及胞内炎症因子IL-12、IL-13无明显差异。结论 DNFB和粉尘螨提取物能够诱导特应性皮炎样皮损,总固有淋巴样细胞在皮损中显著增加,激活的ILC2细胞在皮损中显著增加。该研究对于深入了解半抗原和变应原同时致敏的AD样小鼠模型病理机制具有参考价值。

关键词：特应性皮炎 2 4-二硝基氟苯粉尘螨 Balb/c小鼠固有淋巴样细胞

粉尘螨过敏原β-己糖胺酶的表达、纯化和生物信息学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2015年第2期33卷 159-160,F0003页

作者：莫丽华刘玉琳杨利桃范小琴刘志刚杨平常深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060 南昌大学医学院免疫学教研室南昌330006 深圳大学耳鼻咽喉科研究所深圳518020

合成粉尘螨β-己糖胺酶基因并连接至p ET-28a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组β-己糖胺酶蛋白。通过生物信息学软件分析粉尘螨β-己糖胺酶蛋白基本特性。表达菌经诱导后,高效表达出β-己糖胺酶蛋白,SDS-PAGE结果显... 详细信息

合成粉尘螨β-己糖胺酶基因并连接至p ET-28a载体,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组β-己糖胺酶蛋白。通过生物信息学软件分析粉尘螨β-己糖胺酶蛋白基本特性。表达菌经诱导后,高效表达出β-己糖胺酶蛋白,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量(Mr)约为55 000。粉尘螨β-己糖胺酶基因序列全长1 410 bp,编码469个氨基酸,位于胞外,无信号肽,属亲水性蛋白,其二级结构由14.71%的片层,30.70%的螺旋和54.58%的环组成。

关键词：粉尘螨 &beta -己糖胺酶原核表达

粉尘螨变应原Der f 1 mRNA对小鼠特异性免疫治疗的实验研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2014年第4期32卷 268-273页

作者：姜玉新尹康靳文杰吴露依李朝品皖南医学院基础医学院生理学教研室芜湖241002 皖南医学院临床医学院芜湖241002 皖南医学院基础医学院医学寄生虫学教研室芜湖241002

目的探讨粉尘螨变应原Derf1mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组(10只/组),分别为PBS组、Derf1变应原致敏组、Derf1变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Derf1 mRNA免疫治疗组。分别于第0... 详细信息

目的探讨粉尘螨变应原Derf1mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组(10只/组),分别为PBS组、Derf1变应原致敏组、Derf1变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Derf1 mRNA免疫治疗组。分别于第0、第7和第14天,PBS组小鼠腹腔注射PBS,其余4组小鼠则腹腔注射10μg Der f 1进行致敏,建立小鼠哮喘模型。自第21天起,除PBS组小鼠雾化吸入PBS,其他4组小鼠均雾化吸入100μg/ml Der f 1变应原,30 min/次,1次/d,连续7 d,观察并记录小鼠哮喘发作情况。5组小鼠于最后1次雾化吸入致敏2周后,背部皮下分别注射100μl PBS、1μg Der f1(维持致敏)、10μg Derf1(免疫治疗)、2μgβ-actin mRNA和2μg Derf1mRNA,1次/周,连续3周。最后1次皮下注射后2周处死小鼠。收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)和白介素13(IL-13)水平,并计数嗜酸粒细胞(EOS);收集各组小鼠脾组织,分离脾细胞,除PBS组外,其他4组均加入10μg/ml Der f 1培养72 h,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-13水平;取各组小鼠眼球血,ELISA法检测血清中总IgE以及变应原特异性IgE(sIgE)、IgG1(sIgG1)和IgG2a(sIgG2a)抗体水平。HE染色观察各组小鼠肺组织切片。结果除PBS组外,其他4组小鼠雾化吸入致敏后,均出现急性哮喘发作症状。小鼠BALF中,Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(897.56±105.73)和(864.48±70.62)pg/ml,均明显高于Derf1变应原致敏组[(209.05±52.28)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(219.47±64.72)pg/ml](P<0.01);两者IL-13水平分别为(241.64±31.41)和(321.94±41.07)pg/ml,则明显低于Derf1变应原致敏组[(520.62±43.77)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(507.22±42.26)pg/ml](P<0.01);两者EOS数量分别为(1.33±0.44)×105和(1.48±0.39)×105个/ml,均明显低于Derf1变应原致敏组[(3.54±0.52)×105个/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(2.98±0.53)×105个/ml](P<0.01)。脾细胞培养上清的ELISA检测结果显示,Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(420.91±69.92)和(334.92±43.72)pg/ml,明显高于Der f 1变应原致敏组[(123.75±15.48)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(128.84±59.00)pg/ml](P<0.01);两者IL-13水平[(268.51±40.42)和[(285.26±62.21)pg/ml]则显著低于Der f 1变应原致敏组[(613.89±51.54)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(524.05±39.12)pg/ml](P<0.01)。血清中抗体水平的ELISA检测结果显示,Der f 1 mRNA免疫治疗组的总IgE、sIgE和sIgG1抗体水平分别为(33.72±9.78)、(22.76±8.09)和(17.87±7.59)ng/ml,均显著低于Der f 1变应原致敏组[(94.34±11.66)、(65.67±9.47)和(75.18±9.52)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(86.48±10.26)、(62.36±8.35)和(69.51±8.98)ng/ml](P<0.01);其sIgG2a抗体水平为(7.74±0.88)ng/ml,则明显高于Der f 1变应原致敏组[(2.81±1.17)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(1.06±0.11)ng/ml](P<0.01)。肺组织切片HE染色镜检结果显示,与Der f 1变应原致敏组相比,Der f 1 mRNA免疫治疗组小鼠的气道上皮和肺泡上皮细胞结构基本完整,炎症细胞浸润明显减少。结论 Derf1mRNA疫苗可有效纠正Th1/Th2失衡。

关键词：粉尘螨变应原 mRNA疫苗特异性免疫治疗

粉尘螨过敏原Der f 32的克隆、表达、免疫学鉴定及其对树突状细胞的调节作用研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第3期37卷 279-285页

作者：江贝肖小军欧阳春艳罗新萍孙宝清李靖刘志刚深圳大学生命与海洋科学学院深圳518055 深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518055 广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室广州510120 广州医科大学第一附属医院广州510120

目的克隆、表达粉尘螨Der f 32蛋白,并鉴定其免疫原性及其对树突状细胞(DC)的调节作用。方法合成粉尘螨过敏原Der f 32基因,与pET-24a(+)载体连接,转入大肠埃希菌BL21诱导表达,经亲和层析法纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SD... 详细信息

目的克隆、表达粉尘螨Der f 32蛋白,并鉴定其免疫原性及其对树突状细胞(DC)的调节作用。方法合成粉尘螨过敏原Der f 32基因,与pET-24a(+)载体连接,转入大肠埃希菌BL21诱导表达,经亲和层析法纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)、临床皮肤点刺实验检测重组蛋白的免疫原性。将重组蛋白Der f 32与小鼠来源的DC2.4共培养24 h,设阳性对照组(加等量重组蛋白Der f 1)和阴性对照组(加等量PBS),流式细胞术检测细胞表面共刺激分子(CD40、 CD83和CD80)的表达。将重组蛋白稀释为10、 20、 30、 40、 50、 60μg/ml等不同浓度,分别与DC2.4共培养48 h后, Western blotting分析T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白4 (TIM4)的表达情况。结果SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Der f 32相对分子质量(Mr)约35 000。临床皮肤点刺实验表明, 42位尘螨过敏患者中有6例对重组蛋白Der f 32过敏,阳性率为14.2%。Western blotting结果显示,重组蛋白Der f 32能与皮试阳性患者血清IgE抗体特异性结合。流式细胞术检测结果显示,重组蛋白Der f 32与DC2.4共培养后, CD40、 CD83、 CD80的表达水平分别为24.5%、 9.6%和24.6%,高于阴性对照组(11.9%、 3.1%和15.6%)(P 粉尘螨新过敏原Der f 32,该蛋白能促进DC表面分子和TIM4的表达。

关键词：粉尘螨 Der f 32 免疫原性树突状细胞