检索结果-南通市图书馆

作者：贾艳华河北农业大学

学位级别：硕士

转基因微生物（Genetically modified microorganism, GMM）在农业生产中具有重要作用,其在环境中的安全性问题倍受关注。分子生态学技术的发展为探明细菌的微生态行为提供了有效手段与技术支持。荧光假单胞菌作为重要的生防细菌,起着... 详细信息

转基因微生物（Genetically modified microorganism, GMM）在农业生产中具有重要作用,其在环境中的安全性问题倍受关注。分子生态学技术的发展为探明细菌的微生态行为提供了有效手段与技术支持。荧光假单胞菌作为重要的生防细菌,起着越来越重要的作用,因而构建良好的荧光假单胞杆菌标记系统是非常重要的。本研究重组荧光假单胞菌工程菌BioP8的环境生态安全性结果显示:工程菌BioP8在甘蓝叶片上的总菌落密度维持在10～8CFU/cm左右,抗性菌落维持在10～3 CFU/cm左右;土壤中总菌落密度维持在10～8 CFU/g左右,抗性菌落约为10～2 CFU/g;喷洒工程菌BioP8前后叶片上的芽孢杆菌数维持在10～6CFU/cm;工程菌BioP8在田间的扩散情况实验结果表明,防治后30天后土壤中的总细菌数为10～8 CFU/g,超过5米的土样中没有分离出Rif/Km/Spc抗性菌落,说明BioP8的扩散能力很弱;BioP8在甘蓝植株根部的定殖实验显示抗性菌落在浸根后1天和9天各出现一高峰值,之后逐渐恢复到浸根前的水平,30天后,其在根部的密度为10～3 CFU/g;BioP8悬浮剂防治小菜蛾田间实验调查结果表明,工程菌BioP8速效性比化学农药对照差,防治后7、15天,BioP8防治区对小菜蛾的防效逐步增加,分别达46.4%和85.7%,其防治效果高于灭多威防治区;工程菌BioP8对甘蓝田中天敌种群的影响调查结果表明几种主要天敌昆虫数量和对照区相当。而化防区天敌昆虫数量显著降低,施药后3、7、15天分别比对照减少68.7%、62.5%和36.7%。处理对甘蓝田节肢动物群落存在不同的影响,调查区甘蓝田节肢动物物种个体丰富度有所不同,害虫丰富度依次为空白对照区>化防区>工程菌BioP8防治区;天敌个体丰富度依次为工程菌BioP8防治区>空白对照区>化防区,化学农药对天敌的影响较大,而生防区害虫的数量保持在较低的水平,蜘蛛和天敌均高于化防区;工程菌对甘蓝的生长发育及其它病害发病情况调查结果表明,工程菌BioP8在甘蓝田中不会诱发霜霉、软腐等甘蓝常见病害,也不会对甘蓝产生致病性药害,对甘蓝的生长发育也无不良影响,其长势和化学农药区相当,明显好于空白对照区。用昆虫消化液处理RFP（red fluorescent protein, RFP）结果表明RFP在昆虫消化液中能抵抗蛋白酶的作用,RFP在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中非常稳定,仍发出正常的红色荧光。这也证明了RFP稳定性很强,这些特性将能很好的应用于Cry蛋白在害虫中肠的定位和作用机理等方面的研究。构建了含有红色荧光蛋白基因表达盒的质粒载体pJH3。将rfp基因表达盒分别插入Mini-Tn5转座子和插入到大肠杆菌—荧光假单胞菌穿梭载体pSPCPα-1ac中,得到质粒载体pJH4和pJH5。之后将rfp基因整合到荧光假单胞菌P303和其工程菌BioP8中,分别得到8’P303,8’BioP8;将pJH5转入P303中得到转化子12P303。质粒标记工程菌在366nm紫外光下发出强烈的

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巴西橡胶树潜伏病毒1克隆与鉴定

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作者：陈思熹海南大学

学位级别：硕士

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是全球重要的经济作物之一。天然橡胶属于国防和经济发展不可或缺的重要战略物资。然而,病虫害等生物胁迫和气候环境等非生物胁迫因素严重制约了橡胶树生产与可持续发展。加之橡胶遗传转化体系尚不成熟,... 详细信息

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是全球重要的经济作物之一。天然橡胶属于国防和经济发展不可或缺的重要战略物资。然而,病虫害等生物胁迫和气候环境等非生物胁迫因素严重制约了橡胶树生产与可持续发展。加之橡胶遗传转化体系尚不成熟,极大程度限制了橡胶基因功能与机理研究,以及分子遗传育种工作。因此,建立高效的橡胶树遗传转化体系对于挖掘和探究重要基因功能及推进分子育种具有重要的科学意义与应用价值。现今已有多种植物病毒被发掘,并将其改造成为病毒载体,并因加快植物的研究进程而被广泛地运用。本文鉴定一种新的橡胶树的病毒,由于该病毒感染的橡胶树未表现出任何症状,故将其命名为橡胶树潜伏病毒1(Rubber tree latent virus 1,RTLV1)。该病毒具备开发成为巴西橡胶树瞬时表达病毒载体的潜力,本文对该病毒进行全长基因组克隆、外壳蛋白抗体制备、以及侵染性克隆载体构建及侵染试验,取得以下主要研究结果:1、RTLV1全长全基因组克隆。通过RT-PCR和RACE扩增获得RTLV1病毒全长基因组序列,其序列由9,422个核苷酸(Nt)组成(Gen Bank编号:MW774645),序列分析结果显示,该病毒基因组有三个ORFs,一个157-nt的5’非翻译区(UTR)和一个316-nt的3’UTR。保守结构域分析结果显示,ORF1编码一个297.9 k Da的复制酶,内含4个已知结构域:甲基转移酶、2OG-Fe(II)加氧酶、解旋酶和依赖RNA的RNA聚合酶。ORF2编码一个24.5k Da的运动蛋白(MP)。ORF3编码一个17.82 k Da的外壳蛋白(CP)。RTLV1是一个正链RNA病毒,系统进化树分析结果显示,RTLV1属于帚状病毒科(Virgaviridae)的未定病毒属病毒,与HVLV 11(Hubei virga-like virus 11)病毒亲缘关系最近。2、RTLV1-CP抗体的制备以及初步应用。构建RTLV1-CP蛋白原核表达载体,完成RTLV1-CP蛋白的原核表达和纯化。纯化后蛋白对新西兰大白兔注射,成功获得抗血清,血清效价达到1:102400,且具有良好的特异性。同时通过Western blot分析RTLV1阳性橡胶树叶片样品,结果显示,样品中含有少量RTLV1-CP蛋白。3、侵染性克隆载体的构建。由于RTLV1病毒序列在大肠杆菌中不稳定,容易被修饰,首先以p GBKT7载体为骨架,构建大肠杆菌、酵母和农杆菌三元穿梭载体p BD-CB301。再利用p BD-CB301和p CB301载体为骨架,构建了三个侵染性克隆载体:第一个载体为p BD-CB301并在全长中插入内含子的p BD-CB301-RTLV1-Y,第二个载体为p CB301无内含子的含有完整且连续RTLV1基因组的p CB301-RTLV1-W,以及第三个载体为p CB301并在全长中插入内含子的p CB301-RTLV1-Y。成功转化大肠杆菌和农杆菌,目前p CB301-RTLV1-W载体通过农杆菌介导法已在野生型本氏烟中成功转录,p CB301-RTLV1-Y载体通过农杆菌介导法已在RDR6 RNAi转基因型本氏烟中成功转录。综上所述,本研究鉴定到一种无症状侵染橡胶树的新型病毒RTLV1,通过进行病毒全长基因组克隆、制备病毒外壳蛋白抗体、构建病毒侵染性克隆载体及初步本氏烟草侵染试验,揭示了该病毒具备作为巴西橡胶树瞬时表达病毒载体的应用潜力与价值。

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肉葡萄球菌Tat途径对EGFP蛋白的跨膜转运研究

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作者：许保银天津科技大学

学位级别：硕士

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能在多种原核和真核生物细胞中表达,其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类型的限制,且EGFP具有易于检测、灵敏度高,荧光性质稳定,对细胞无毒害,可直接用于活细胞测定等特性,被广泛应用于生命科学的各个领域... 详细信息

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能在多种原核和真核生物细胞中表达,其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类型的限制,且EGFP具有易于检测、灵敏度高,荧光性质稳定,对细胞无毒害,可直接用于活细胞测定等特性,被广泛应用于生命科学的各个领域。肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)具有不产生任何毒素、溶血素、凝固酶、胞外蛋白水解活性低等特点,在基因工程中可以做为良好的宿主菌。蛋白质在细胞质合成并被转运至细胞壁外的过程中,需要信号肽的引导。目前在基因工程中,外源蛋白通常使用的分泌途径为Sec途径,但Sec转运系统只能转运未折叠或部分折叠的蛋白质,而Tat分泌系统能分泌正确折叠的蛋白质,因此Tat分泌途径能分泌一些无法用Sec途径分泌的蛋白质。穿梭载体具有二种不同的复制子,能在两种或多种宿主之间进行复制,穿梭载体在细菌中一般用于基因的扩增。本研究首先通过PCR方法获得20种N-末端带有连续5个相同氨基酸接头的EGFP融合基因(5x-egfp),导入大肠杆菌-葡萄球菌穿梭质粒pBT2-ET-EGFP中,构建成pBT2-ET-5X-EGFP重组质粒,再电转化入肉葡萄球菌TM300宿主中,研究肉葡萄球菌Tat途径对外源蛋白分泌表达的影响。本研究构建的 *** TM300/pBT2-ET-EGFP 与 *** TM300/pBT2-ET-5X-EGFP基因工程重组子经发酵培养,通过荧光显微镜检测到菌体能够发出绿色荧光,使用流式细胞仪检测到了荧光细胞,说明EGFP在重组子内已成功表达,使用蛋白电泳及Western blot分别检测重组子细胞壁和发酵液中的EGFP,结果表明重组子 *** TM300/pBT2-ET-EGFP、*** TM300/pBT2-ET-5X-EGFP中表达的EGFP分泌到了细胞壁上,且以单体和二聚体二种形式存在,重组子*** TM300/pBT2-ET-5X-EGFP中的EGFP以二聚体的形式分泌到发酵液中。利用荧光分光光度计分别检测EGFP在重组子细胞壁和发酵液中的活性,结果显示分泌到细胞壁中的EGFP具有活性,分泌到发酵液中的EGFP未检测到活性。ELISA定量试剂盒检测到发酵液中EGFP的含量为100～150 ng/L。

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鸭疫里默氏杆菌TonB1和TonB2基因缺失株的构建

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作者：苗双中国农业科学院

学位级别：硕士

鸭疫里默氏杆菌感染(Riemerella anatipestifer infection)是鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种高致病性、接触性传染病，又称作鸭传染性浆膜炎。本病呈现出急性或者慢性的败血症，以肝周炎、纤维素性心包炎、脑膜炎和气囊炎为特征，是目前... 详细信息

鸭疫里默氏杆菌感染(Riemerella anatipestifer infection)是鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种高致病性、接触性传染病，又称作鸭传染性浆膜炎。本病呈现出急性或者慢性的败血症，以肝周炎、纤维素性心包炎、脑膜炎和气囊炎为特征，是目前危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一，该病因其高死亡率给养鸭业造成巨大的经济损失。目前已确定的鸭疫里默氏杆菌血清型至少有21个，且血清型之间交叉保护性很低，这给该病的防控带来很大的困难。目前关于鸭疫里默氏杆菌分子致病性机制研究才刚刚起步。本文构建了大肠杆菌—鸭疫里默氏杆菌穿梭载体，这为鸭疫里默氏杆菌基因功能的研究提供了一种重要的工具。同时还构建了鸭疫里默氏杆菌TonB1、TonB2基因缺失株及相应的互补菌株，研究表明这两个基因在鸭疫里默氏杆菌致病性和铁离子摄取过程中起着重要的作用。一.大肠杆菌—鸭疫里默氏杆菌穿梭载体pRES的构建本研究在质粒pCP29的基础上进行改造，成功地构建了大肠杆菌－鸭疫里默氏杆菌穿梭载体pRES。该穿梭载体含有鸭疫里默氏杆菌pRA0726质粒复制起始区域的DNA序列以及大肠杆菌的ColE1复制原点，可使其在鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌中均能复制;含有的推测的ompA基因启动子序列和多克隆位点，以便于将外源基因克隆到pRES载体上，并能在鸭疫里默氏杆菌中表达。稳定性试验表明pRES载体能在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在。二、鸭疫里默氏杆菌TonB1基因和TonB2基因缺失株的构建本研究采用接合转导的方法将重组的自杀质粒导入鸭疫里默氏杆菌中，经同源重组的方法成功构建了鸭疫里默氏杆菌TonB1基因和TonB2基因的缺失突变株CH3△TonB1和CH3△TonB2;然后将TonB1基因和TonB2基因的ORF分别连入大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭载体pRES中，构建了互补质粒pRES-TonB1和pRES-TonB2，再通过接合转导的方法导入缺失株中，成功构建了两株基因缺失株的互补株cCH3△TonB1和cCH3△TonB2，并对基因缺失株的生物学特性进行了初步研究。研究结果表明，TonB1基因和TonB2基因缺失株生长速度比亲本株CH3减慢;在TSB培养基中加入200μM DIP以螯合培养基中的铁离子，然后加入FeCl3，holo-transferrin，hemoglobin等不同形式的铁，发现缺失株不能利用这些铁离子生长，而基因互补株和亲本株则可以利用这些铁离子而生长。另外，研究发现缺失株CH3△TonB1和CH3△TonB2的生物被膜形成能力严重减弱、对Vero细胞的粘附入侵能力显著降低，而互补株则回复以上缺陷至与亲本株CH3株相近的水平。对雏鸭的致病性研究结果表明缺失株CH3△TonB1和CH3△TonB2对雏鸭的致病性（LD50）分别比亲本株CH3株降低大于450倍和90倍，而且缺失株CH3△TonB1和CH3△TonB2株感染鸭在感染后12h和24h血液中的细菌载量比亲本株相比显著性降低。以上结果表明TonB1和TonB2蛋白是与毒力相关的因子，且在CH3株的获铁过程中起着重要的作用。本研究为进一步深入地解析鸭疫里默氏杆菌的获铁系统及其分子致病机制等奠定了基础。

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嗜盐古生菌温和病毒SNJ2复制机制的初步研究

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作者：刘迎春武汉大学

学位级别：硕士

SNJ2是嗜盐古生菌Natrinema sp.J7-1中一株温和性包膜病毒,属于多形性病毒科,Betapleolipovirus属,SNJ2病毒基因组编码25个预测ORFs,基因组大小16992 bp。SNJ2的前病毒整合在宿主基因组tRNA基因3’末端,整合位点为14 bp的正向重复序列,... 详细信息

SNJ2是嗜盐古生菌Natrinema sp.J7-1中一株温和性包膜病毒,属于多形性病毒科,Betapleolipovirus属,SNJ2病毒基因组编码25个预测ORFs,基因组大小16992 bp。SNJ2的前病毒整合在宿主基因组tRNA基因3’末端,整合位点为14 bp的正向重复序列,其自身编码的位点特异性重组系统既可介导进入裂解循环时前病毒从染色体上的切离和环化,也可使感染宿主细胞的环状病毒基因组重新整合到宿主染色体上,形成溶源化状态。SNJ2以何种方式进行复制尚不清楚,本论文以此为基础探索SNJ2基因组在宿主细胞内的复制机制。首先,构建了含有SNJ2基因组全长的***-Natrinema sp.J7-1穿梭载体pFSNJ2。我们将pFSNJ2嗜盐转化至J7-3-F菌株后,从传第三代的J7-3-F/pFSNJ2菌株中提取质粒转化至大肠杆菌,多次重复仅挑取到一个转化子。提取该转化子的质粒,酶切后的片段大小相较于酶切初始构建的pFSNJ2有所缩短,说明pFSNJ2即使能在J7-3-F中以游离形式复制,也并不稳定。进一步检测pFSNJ2在J7-3-F中的存在形式,发现在J7-3-F/pFSNJ2传代的培养物中检测到重组产物接头attBOP,说明pFSNJ2整合至宿主染色体上,用MMC对该菌株进行诱导,在上清液和细胞沉淀中未检测到病毒从宿主基因组切离后形成的环化接头attP’OP,推测整合在宿主染色体上的pFSNJ2影响了切离反应,也可能pFSNJ2不能以质粒形式进行复制。实验室前期工作已证实SNJ2上orf1编码的整合酶是负责前病毒特异性切离、整合的关键因子。因此,我们利用整合酶的特性探索SNJ2是否能游离于宿主染色体外进行复制。在缺陷型菌株J7-1-FΔorf1::pyrF中导入单独表达orf1的质粒后进行MMC诱导,收获缺陷型病毒SNJ2Δorf1::pyrF侵染J7-3-F。和预期一样,检测不到attBOP和attP’OP,这是因为该缺陷病毒没有整合酶编码基因,因此无法整合到染色体上,但我们始终未能挑取到稳定携带SNJ2Δorf1::pyrF的宿主菌株,说明该缺陷病毒的游离基因组在宿主细胞中非常不稳定,传代易丢失,极有可能不能以游离形式完成自我复制。作为对照,用SNJ2Δorf1::pyrF侵染整合酶回补株J7-3-F/pYCJ-2300,在侵染株中能检测到attBOP和attP’OP,说明在J7-3-F内表达整合酶后,SNJ2Δorf1::pyrF可以整合至宿主染色体上,也可以从宿主染色体上切离。综合以上结果表明缺陷型病毒SNJ2Δorf1::pyrF可以吸附并注入宿主J7-3-F中,但其因缺乏整合酶不能整合至宿主基因组上,SNJ2Δorf1::pyrF传代中易丢失,推测其不能以游离形式完成自我复制,暗示SNJ2基因组通过整合至宿主染色体上才能复制。已知正常生长的J7-1中,SNJ2以较低程度复制释放病毒颗粒,经MMC处理后,SNJ2进入裂解循环可大量复制释放病毒颗粒。为了解J7-1经MMC诱导后SNJ2在细胞内大量复制的时间,我们通过Q-PCR对J7-1经MMC诱导前后每个细胞内SNJ2的拷贝数进行了测定。结果显示,J7-1在未诱导时,SNJ2基因组主要以整合状态存在,MMC诱导后,细胞内游离的SNJ2基因组在4 h开始大量增加,推测SNJ2基因组大量复制的时间是J7-1经诱导后4 h,J7-1经MMC诱导后8 h,attBOP

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贝氏柯克斯体质粒生物学作用与功能研究

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作者：罗声栋中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称Cb)是一种革兰氏阴性、专性胞内寄生菌,是引起人类Q热的病原体[1-3]。Cb主要通过气溶胶[4]、蜱虫叮咬等途径,在人与动物之间进行传播,是已知的感染性最强的病原体之一,也是一种潜在的生物战剂[5]和... 详细信息

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称Cb)是一种革兰氏阴性、专性胞内寄生菌,是引起人类Q热的病原体[1-3]。Cb主要通过气溶胶[4]、蜱虫叮咬等途径,在人与动物之间进行传播,是已知的感染性最强的病原体之一,也是一种潜在的生物战剂[5]和生物恐怖剂[6]。研究发现:已知的Cb分离株中均含有一种质粒(QpH1[7]、QpRS[8]、QpDG[9]、QpDV[10,11])或者整合到Cb基因组的质粒同源序列(IPS[8,12]);Cb质粒编码多个IV型分泌系统效应蛋白[13,14],这些蛋白分泌到宿主细胞质后,参与调控细胞功能[15]。长期以来,Cb质粒(包括IPS)被认为可能是菌体生长或胞内寄生所需的关键因子,又或者可能跟Cb的环境耐受和所引起的疾病种类(急性Q热或慢性Q热)相关。由于培养困难及缺少Cb质粒的遗传操作方法,Cb质粒及其编码基因的生物学功能和致病机制均缺乏研究。近年来,无生命培养基ACCM[16,17]培养Cb方法的建立,推动了Cb的遗传学研究进展,为研究Cb基因的功能创造了机遇。本论文参考国外已有的Cb遗传操作方法[18,19],通过基因工程技术构建Cb穿梭载体,建立了Cb的遗传转化方法;利用质粒相似不兼容机制[20-22],成功构建了Cb內源质粒QpH1缺失突变体,并在体内、外对Cb质粒缺失突变体的表型和毒力变化等进行了初步的探讨;利用基因敲除和定点突变等技术,对Cb內源质粒QpH1的复制与分裂调控区进行了深入的探讨。第一章,基于***质粒pMMB207[23],构建含RSF1010 ori的贝氏柯克斯体自主穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。首先,利用PCR技术分别扩增绿色荧光蛋白基因(eGFP)、卡那霉素抗性基因(KanR)、Cb组成型表达基因启动子P311和P1169四段序列,以及含RSF1010 ori的载体骨架p207;然后,用融合PCR技术将四段序列融合为“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列;最后,用限制性核酸内切酶Kpn I和Xho I酶切“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列,连接至同样双酶切的载体骨架p207上,构建穿梭载体p207GK。将穿梭载体p207GK电转化至Cb Grita II相株,用无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养,利用倒置荧光显微镜观察e GFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用单层半固体“ACCM-2/Kan/琼脂”平板克隆分纯Cb转化株;结果成功构建了自主的Cb穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的Cb转化株,并完成了克隆分纯。表明我们成功建立了Cb遗传转化系统,为后续用遗传学方法研究Cb奠定了基础。第二章,生物信息学分析本室Cb Grita II相株质粒全长序列,确定该质粒为QpH1(GeneBank Accession ***016829),BLAST比对分析发现该质粒的CBUA0036BUA0039a序列片段在IPS中缺失,但在4种质粒(QpH1,QpRS,QpDG,QpDV)中存在且高度保守,推测该段序列可能是调控Cb质粒复制与分裂的功能区,包含复制起始位点序列和相关质粒分裂调控蛋白基因。利用PCR扩增技术,从质粒QpH1上扩增获得包含CBUA0036BUA0039a序列的片段,作为同源型质粒的骨架(命名为pQ);同时利用融合PCR扩增技术,使eGFP基因、KanR基因、P311和P1169启动子,以及p UC ori序列融合,形成“P311-eGFPP1169-KanR-pUC ori”串联序列;把串联序列亚克隆至载体骨架pQ上,构建新型穿梭载体p QGK。将新型穿梭载体pQGK电转化至Cb Grita II相菌中,用含Kan的无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养,通过荧光显微镜进行观察。结果发现新型穿梭载体pQGK能在Cb中稳定地传代,荧光激发下使Cb转化菌呈现绿色荧光,这说明新型穿梭载体pQGK上的CBUA0036BUA0039a序列片段含有pQGK质粒的复制起始位点序列(ori)。对转化菌克隆分纯后,用QpH1质粒特异性引物对Cb克隆株进行PCR鉴定,未能检测到QpH1质粒,说明Cb克隆株中的QpH1质粒已经丢失,获得了Cb內源质粒QpH1缺失突变株Cb Grita II/p QGK;利用SYBR Green绝对定量Q-PCR技术分别测定Cb野生株中QpH1质粒和突变株Cb Grita II/pQGK中pQGK质粒的相对拷贝数,发现Qp H1与pQGK质粒都只有单拷贝;以上数据说明QpH1与pQGK质粒具有相同的复制与分裂调控机制,两者在Cb中不能共存,表明CBUA0036BUA0039a这段序列能严格地调控质粒QpH1的复制、分裂及相似不兼容。用Q-PCR技术测定突变株Cb Grit

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曲霉耐盐突变体耐盐相关基因的发掘研究

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作者：谢丽华中国林业科学研究院

学位级别：硕士

曲霉耐盐突变体CCHA（Aspergillus glaucus CCHA）菌株是由吉林大学张世宏实验室从晒盐场盐池周边分离筛选的1株极端耐盐真菌，前期研究证明该菌具有较强的耐盐性，为了挖掘其耐盐相关基因，探索其耐盐的分子机制，本研究在对其进行全... 详细信息

曲霉耐盐突变体CCHA（Aspergillus glaucus CCHA）菌株是由吉林大学张世宏实验室从晒盐场盐池周边分离筛选的1株极端耐盐真菌，前期研究证明该菌具有较强的耐盐性，为了挖掘其耐盐相关基因，探索其耐盐的分子机制，本研究在对其进行全基因组测序的基础上，利用大肠杆菌表达系统构建盐胁迫后曲霉突变体的cDNA文库，并进行耐盐基因的筛选，对筛选得到的高耐盐克隆进行了测序、生物信息学分析及初步的耐盐性鉴定。本研究为阐明曲霉突变体的耐盐机制、挖掘耐盐相关基因及林木耐盐转基因育种提供物质（基因）基础和理论依据。Solaxa高通量全基因组测序结果表明，曲霉耐盐突变体基因组大小约为28.9Mb，有效长度大于1kb的contigs有313个，有效长度大于1kb的scaffolds有105个，通过生物信息学方法预测得到10066个unigenes。曲霉耐盐突变体CCHA在含有170g·L-1NaCl的培养基上培养一周后提取RNA，构建盐胁迫后曲霉耐盐突变体的cDNA文库。原始文库滴度为4.8×106pfu·mL-1，重组率约为90%，插入片段集中在500-1500bp范围内，平均长度大于750bp。对随机挑选的130个单克隆进行测序，获得了100条有效序列，利用NCBI的blastx进行比对结果表明82条序列有相应的同源序列和相关注释信息，它们分别与信号转导、渗透物合成、转录调控相关。提取文库的混合质粒DNA，电激转化*** BL21Star (DE3)，文库滴度为1.6×104pfu·mL-1，在含有不同浓度的NaCl培养基中进行耐盐克隆筛选，共得到60个耐盐克隆可以耐受0.7mol·L-1NaCl，其中有5个可以耐受1M NaCl，针对这5个高耐盐克隆插入序列进行了测序和blastx分析，其中CCHA-2229属于COGO428基因家族成员（质膜低锌离子转运蛋白），CCHA-2247属于60s核糖体蛋白L27e基因家族成员。通过点板试验和生长反应曲线测定试验发现，在1mol·L-1NaCl盐胁迫条件下含有这5个插入片段的转基因大肠杆菌生长情况均好于仅转化空载的大肠杆菌，可以初步确定外源基因提高了大肠杆菌的耐盐性，不同盐胁迫处理时间下5个基因的转录水平的变化进一步说明这些基因与曲霉耐盐突变体CCHA的耐盐性密切相关。另外选择了其中两个耐盐新基因，将其插入片段构建到改造过的植物超表达载体pBI121G中，通过浸花法转化拟南芥中，分析盐胁迫条件下的拟南芥表型试验可以观察到，当十天大小的幼苗转移至150mM NaCl的1/2MS培养基后，野生型拟南芥几乎全部萎蔫，而转基因拟南芥只有部分萎蔫。胁迫前后耐盐生理指标分析表明：胁迫条件下转基因拟南芥的SOD活性、叶绿素含量均显著高于对照，而MDA含量低于对照，这些结果进一步说明，CCHA-2142和CCHA-2114的超表达可以提高拟南芥的耐盐性。

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枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆与功能表达研究

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作者：杨朝霞西北农林科技大学

学位级别：硕士

本研究以大肠杆菌（E. coli）克隆载体pUC19为模板，分别用两对引物扩增了含有复制起始序列（ori）和复制蛋白基因（rep）的700bp 片段，以枯草芽孢杆菌（***）质粒载体pGDV1为基本骨架，构建了三个带有氯霉素抗性基因的大肠杆菌－枯草... 详细信息

本研究以大肠杆菌（E. coli）克隆载体pUC19为模板，分别用两对引物扩增了含有复制起始序列（ori）和复制蛋白基因（rep）的700bp 片段，以枯草芽孢杆菌（***）质粒载体pGDV1为基本骨架，构建了三个带有氯霉素抗性基因的大肠杆菌－枯草芽孢杆菌小型穿梭载体pGDVM、pGDVM1和pGDVM2。经大肠杆菌－枯草杆菌反复穿梭实验和细菌连续培养分析检测，结果证明：含大肠杆菌pUC19复制起始区（ori）和复制起始蛋白基因（rep）的700bp克隆片段在大肠杆菌中具有完全的复制功能;构建的三个质粒载体在大肠杆菌和枯草杆菌中能稳定地遗传。这三个穿梭质粒载体分子较小，仅3kb左右;具有较高的拷贝数（在枯草杆菌中约150-200拷贝数），带有多个不同的克隆位点，方便插入目标基因，并且带有氯霉素抗性基因，可以为受体菌提供理想的抗性筛选标记。该系列载体可以作为枯草杆菌理想的基因工程菌构建骨架。本研究成功地克隆了枯草杆菌生物素操纵子基因bioB、bioW 和基因簇bioWAFDB片段;以大肠杆菌表达质粒载体pEXT20为骨架，分别构建了bioW、bioB和bioWAFDB诱导型表达载体pEXT20bioW、pEXT20bioB和pEXT20bioWAFDB，可以通过IPTG诱导，在大肠杆菌中进行表达。通过它们与大肠杆菌生物素生物合成基因系列bioF、bioB、bioC、bioD和bioA缺陷株R874、R875、R876、R877和R879的遗传互补实验，证明：枯草杆菌生物素基因bioA、bioB、bioD和 bioF在大肠杆菌中功能正常;bioW基因（编码庚二酰CoA合成酶）的表达载体对大肠杆菌缺陷株没有遗传互补作用，但是bioW基因编码的庚二酰CoA合成酶在大肠杆菌中有催化活性，可以催化外源的庚二酸合成庚二酰CoA，为生物素合成途径提供底物。经过IPTG不同水平的诱导表达实验，发现：枯草杆菌生物素基因bioWAFDB的过量表达对受体菌的生长有严重抑制作用，该抑制作用主要是由bioW引起，并且不能通过添加二氨基庚二酸而解除。枯草杆菌bioB基因诱导表达产物未对大肠杆菌的生长造成抑制，实验结果为枯草杆菌生物素基因工程菌的构建及生物素发酵生产提供了有价值的理论依据。

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黑暗链霉菌选育及其生物合成信息流阻断的探索

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作者：林玉双福州大学

学位级别：硕士

黑暗链霉菌是重要的氨基糖苷类抗生素——安普霉素和妥布霉素的产生菌，为不断提高其发酵单位，采用常规育种手段进行选育，获得了高产菌株。为进一步提高产生菌的质量，拟采用现代基因工程技术，阻断不同组分的生物合成信息流，以期获... 详细信息

黑暗链霉菌是重要的氨基糖苷类抗生素——安普霉素和妥布霉素的产生菌，为不断提高其发酵单位，采用常规育种手段进行选育，获得了高产菌株。为进一步提高产生菌的质量，拟采用现代基因工程技术，阻断不同组分的生物合成信息流，以期获得单组分工程菌。以敲除妥布霉素生物合成相关基因tobS1-tobC为目标，完成相关接合转移质粒的构建，并对接合转移体系进行初步研究。黑暗链霉菌出发菌株Ts-228，经自然分离、紫外诱变和耐自身代谢产物处理，琼脂块法初筛结合摇瓶发酵来筛选高产菌，获得了效价提高1.8倍的新菌株Tt-49。该菌株生长周期4天，传代稳定。种龄为18h左右，接种量10％。于50L罐上发酵绘制代谢曲线，按照该曲线图进行调控，发酵单位可稳定在5000u/mL以上，最高达5865u/mL。自然分离与诱变相结合，是黑暗链霉菌选育的有效途径。菌株经紫外诱变和耐受驯化，发酵单位显著提高，所得的高产菌株已用于工业化生产。溶氧是妥布霉素发酵生产中的重要调控因子。以质粒pBR322、pUC19和pIJ773为基础，构建出含四环素抗性基因的重组质粒pIJ791，为后续黑暗链霉菌相关基因的敲除提供了筛选标记。同时去除了质粒pIJ773上多余的SacI酶切位点，可作为基因替换的母质粒。利用PCR的方法，以黑暗链霉菌Tt-49基因组DNA为模板，扩增tobS1-tobC上游片段和下游片段作为同源交换臂，两端携带FRT重组臂的四环素抗性基因作为筛选标记，插入到质粒pKC1139中，构建接合转移质粒pKC1150。CaCl2法制备供体菌ET12567/pUZ8002/pKC1150。初步考察了将穿梭载体pKC1150导入黑暗链霉菌的适宜条件后，成功将pKC1150转入到黑暗链霉菌Tt-49中。为下一步阻断妥布霉素生物合成基因簇上tobC基因（编码2-脱氧青蟹肌醇合酶）和tobS1基因（编码2-脱氧-青蟹肌醇转氨酶）奠定了基础。

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植物乳杆菌质粒表达系统的构建

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作者：冉海明华中农业大学

学位级别：硕士

乳酸菌是人体肠道微生物组成成分,为普遍公认的安全菌株,应用于食品工业中,作为表达系统的宿主菌相比其他微生物有天然优势。本课题从传统食品中分离到一株乳酸菌,经过16S rRNA测序与序列比对,结合传统的生理生化实验,鉴定为植物乳杆菌... 详细信息

乳酸菌是人体肠道微生物组成成分,为普遍公认的安全菌株,应用于食品工业中,作为表达系统的宿主菌相比其他微生物有天然优势。本课题从传统食品中分离到一株乳酸菌,经过16S rRNA测序与序列比对,结合传统的生理生化实验,鉴定为植物乳杆菌的近缘种戊糖乳杆菌,命名为戊糖乳杆菌JS1(Lactobacillus pentosus JS1)。此菌株中含有一个大小为13kb的天然质粒,使用引物步移法获得质粒的序列,拼接得到质粒全长13205bp。通过与NCBI数据库比对,确定质粒为一个新的质粒,命名为pJS1。其G+C含量为35%,有14个开放阅读框。序列分析发现,质粒含有两个复制子,分别命名为ori1与ori2。两个复制子的序列相似达80%,ori1含有长度为22bp的4.8个重复正向重复序列;ori2含有4.5个重复正向重复序列。两个重复序列仅两个碱基差异。在复制子下游均紧接一个可能与复制子相关的repB。为确定最小复制子,将含有复制子序列的不同的片段克隆到大肠杆菌质粒pUCM构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体。结果表明,两个含复制子片段均可在胞内复制,ori1的最小复制子包括完整的正向重复序列,完整的复制起始蛋白基因RepB。ori2最小复制子包括完整的正向重复序列,完整的RepB1蛋白基因。宿主范围试验结果表明,该质粒复制子只能在***,***中复制传代,为一个窄宿主质粒。用绝对定量法测定质粒pJS1在戊糖乳杆菌JS1中不同生长时期的质粒拷贝数,结果显示,在对数期前期拷贝数最高,有19个拷贝,之后拷贝数逐渐降低,到对数期末期到稳定期,拷贝数稳定为7个。对含有质粒复制子ori2的重组子进行的传代稳定性试验,结果表明,构建的穿梭载体在宿主中稳定,100次传代的代间丢失率低于5%。利用ori2构建的表达载体,以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)为指示蛋白,结果表明,在*** ST-III,*** LPHS,*** LPC-37中均可成功检测到荧光。

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