枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆与功能表达研究

作     者：杨朝霞 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郁枫

授予年度：2004年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：枯草杆菌 大肠杆菌 穿梭载体 生物素操纵子基因 诱导表达 

摘      要：本研究以大肠杆菌（E. coli）克隆载体pUC19为模板，分别用两对引物扩增了含有复制起始序列（ori）和复制蛋白基因（rep）的700bp 片段，以枯草芽孢杆菌（***）质粒载体pGDV1为基本骨架，构建了三个带有氯霉素抗性基因的大肠杆菌－枯草芽孢杆菌小型穿梭载体pGDVM、pGDVM1和pGDVM2。经大肠杆菌－枯草杆菌反复穿梭实验和细菌连续培养分析检测，结果证明：含大肠杆菌pUC19复制起始区（ori）和复制起始蛋白基因（rep）的700bp克隆片段在大肠杆菌中具有完全的复制功能;构建的三个质粒载体在大肠杆菌和枯草杆菌中能稳定地遗传。这三个穿梭质粒载体分子较小，仅3kb左右;具有较高的拷贝数（在枯草杆菌中约150-200拷贝数），带有多个不同的克隆位点，方便插入目标基因，并且带有氯霉素抗性基因，可以为受体菌提供理想的抗性筛选标记。该系列载体可以作为枯草杆菌理想的基因工程菌构建骨架。 本研究成功地克隆了枯草杆菌生物素操纵子基因bioB、bioW 和基因簇bioWAFDB片段;以大肠杆菌表达质粒载体pEXT20为骨架，分别构建了bioW、bioB和bioWAFDB诱导型表达载体pEXT20bioW、pEXT20bioB和pEXT20bioWAFDB，可以通过IPTG诱导，在大肠杆菌中进行表达。通过它们与大肠杆菌生物素生物合成基因系列bioF、bioB、bioC、bioD和bioA缺陷株R874、R875、R876、R877和R879的遗传互补实验，证明：枯草杆菌生物素基因bioA、bioB、bioD和 bioF在大肠杆菌中功能正常;bioW基因（编码庚二酰CoA合成酶）的表达载体对大肠杆菌缺陷株没有遗传互补作用， 但是bioW基因编码的庚二酰CoA合成酶在大肠杆菌中有催化活性，可以催化外源的庚二酸合成庚二酰CoA，为生物素合成途径提供底物。经过IPTG不同水平的诱导表达实验，发现：枯草杆菌生物素基因bioWAFDB的过量表达对受体菌的生长有严重抑制作用，该抑制作用主要是由bioW引起，并且不能通过添加二氨基庚二酸而解除。枯草杆菌bioB基因诱导表达产物未对大肠杆菌的生长造成抑制，实验结果为枯草杆菌生物素基因工程菌的构建及生物素发酵生产提供了有价值的理论依据。