曲霉耐盐突变体耐盐相关基因的发掘研究

作     者：谢丽华 

作者单位：中国林业科学研究院 

学位级别：硕士

导师姓名：卓仁英

授予年度：2013年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：盐胁迫 cDNA文库 基因工程 穿梭载体 耐盐基因 

摘      要：曲霉耐盐突变体CCHA（Aspergillus glaucus CCHA）菌株是由吉林大学张世宏实验室从晒盐场盐池周边分离筛选的1株极端耐盐真菌，前期研究证明该菌具有较强的耐盐性，为了挖掘其耐盐相关基因，探索其耐盐的分子机制，本研究在对其进行全基因组测序的基础上，利用大肠杆菌表达系统构建盐胁迫后曲霉突变体的cDNA文库，并进行耐盐基因的筛选，对筛选得到的高耐盐克隆进行了测序、生物信息学分析及初步的耐盐性鉴定。本研究为阐明曲霉突变体的耐盐机制、挖掘耐盐相关基因及林木耐盐转基因育种提供物质（基因）基础和理论依据。 Solaxa高通量全基因组测序结果表明，曲霉耐盐突变体基因组大小约为28.9Mb，有效长度大于1kb的contigs有313个，有效长度大于1kb的scaffolds有105个，通过生物信息学方法预测得到10066个unigenes。 曲霉耐盐突变体CCHA在含有170g·L-1NaCl的培养基上培养一周后提取RNA，构建盐胁迫后曲霉耐盐突变体的cDNA文库。原始文库滴度为4.8×106pfu·mL-1，重组率约为90%，插入片段集中在500-1500bp范围内，平均长度大于750bp。对随机挑选的130个单克隆进行测序，获得了100条有效序列，利用NCBI的blastx进行比对结果表明82条序列有相应的同源序列和相关注释信息，它们分别与信号转导、渗透物合成、转录调控相关。 提取文库的混合质粒DNA，电激转化*** BL21Star (DE3)，文库滴度为1.6×104pfu·mL-1，在含有不同浓度的NaCl培养基中进行耐盐克隆筛选，共得到60个耐盐克隆可以耐受0.7mol·L-1NaCl，其中有5个可以耐受1M NaCl，针对这5个高耐盐克隆插入序列进行了测序和blastx分析，其中CCHA-2229属于COGO428基因家族成员（质膜低锌离子转运蛋白），CCHA-2247属于60s核糖体蛋白L27e基因家族成员。通过点板试验和生长反应曲线测定试验发现，在1mol·L-1NaCl盐胁迫条件下含有这5个插入片段的转基因大肠杆菌生长情况均好于仅转化空载的大肠杆菌，可以初步确定外源基因提高了大肠杆菌的耐盐性，不同盐胁迫处理时间下5个基因的转录水平的变化进一步说明这些基因与曲霉耐盐突变体CCHA的耐盐性密切相关。 另外选择了其中两个耐盐新基因，将其插入片段构建到改造过的植物超表达载体pBI121G中，通过浸花法转化拟南芥中，分析盐胁迫条件下的拟南芥表型试验可以观察到，当十天大小的幼苗转移至150mM NaCl的1/2MS培养基后，野生型拟南芥几乎全部萎蔫，而转基因拟南芥只有部分萎蔫。胁迫前后耐盐生理指标分析表明：胁迫条件下转基因拟南芥的SOD活性、叶绿素含量均显著高于对照，而MDA含量低于对照，这些结果进一步说明，CCHA-2142和CCHA-2114的超表达可以提高拟南芥的耐盐性。