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膜联蛋白A6促进神经祖细胞定向少突胶质细胞分化发育的机制研究

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第三军医大学学报 2021年第21期43卷 2343-2349页

作者：乐一帆范睿诚徐扬李红丽陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院组织学与胚胎学教研室重庆市神经科学重点实验室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院妇产科重庆400037 陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院教学实验中心重庆400038

目的探讨膜联蛋白A6(annexin A6,AnxA6)调控神经祖细胞(neural progenitor cells,NPCs)定向少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)分化的作用机制。方法构建AnxA6基因敲减(AnxA6敲减组)和过表达(AnxA6过表达组)病毒载体,以空载体作为对照组。运用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色、活细胞钙成像等技术,对比检测AnxA6敲减与过表达后,体外培养的NPCs胞内Ca^(2+)的动态变化差异及其对定向分化转录因子Olig2(定向OLs)、Hes1、Ascl1等表达的影响,评估AnxA6对NPCs分化过程的影响。结果与对照组相比,AnxA6敲减组未见明显AnxA6蛋白条带(P细胞可见胞内Ca2+自发振荡的频率和振幅均高于对照组和AnxA6敲减组;在NPCs分化3 d的细胞中,可见AnxA6过表达组Olig2 mRNA表达升高,而Hes1、Ascl1 mRNA则表达减少;Olig2荧光阳性细胞的百分率升高,CNPase荧光信号代表的髓鞘分布增大;同时突起形成相关细胞骨架因子Vimentin、Fyn mRNA的表达显著上调(P细胞内Ca^(2+)的动力变化,还促进OLs定向转录因子的表达,加快髓鞘形成。

关键词：膜联蛋白A6 神经祖细胞少突胶质细胞钙离子细胞分化髓鞘形成

SMA患者来源iPSCs神经祖细胞分化过程中PCDHα6选择性表达异常及其调控机制研究

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SMA患者来源iPSCs神经祖细胞分化过程中PCDHα6选择性表达异常及...

作者：罗倩广州医科大学

学位级别：硕士

【背景】脊髓性肌萎缩综合征(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是由SMN1基因突变引起SMN蛋白表达减少导致运动神经元变性和肌肉萎缩的罕见常染色体遗传病,是新生儿致死主要疾病之一。SMN蛋白下调会引起神经元轴突受损、神经肌肉接头减少、... 详细信息

【背景】脊髓性肌萎缩综合征(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是由SMN1基因突变引起SMN蛋白表达减少导致运动神经元变性和肌肉萎缩的罕见常染色体遗传病,是新生儿致死主要疾病之一。SMN蛋白下调会引起神经元轴突受损、神经肌肉接头减少、信号传导受阻。PCDH基因簇在神经发育中必不可少,具有轴突形成、树突自我回避、神经元存活等功能。PCDH亚基因选择性表达可作为神经元细胞结构及功能独特性的表面标志物。然而PCDH基因簇在运动神经元发育过程中的功能及选择表达的调控机制目前还不清楚,其在SMA疾病发病过程中变性的运动神经元细胞和萎缩的肌肉细胞中的选择性表达模式及调控机制也还有待阐明。【实验目的】通过建立SMA疾病体外神经分化模型研究原钙黏蛋白PCDH亚基因在正常及SMA神经祖细胞分化过程中的选择性表达情况,以及调控PCDH亚基因选择性表达异常的调控机制。【实验方法】1、通过免疫荧光染色、流式细胞术、RT-qPCR等实验验证SMA-iPSCs的多能性;采用畸胎瘤形成实验、EB形成实验验证其体内外分化能力。通过SMADI神经诱导培养建立iPSCs向神经祖细胞的体外分化体系;通过免疫荧光染色、RT-qPCR实验验证神经祖细胞标志物。2、通过RNA-seq测序寻找SMA疾病组与正常组细胞在体外神经分化过程中的差异基因并通过RT-qPCR实验验证。采用小干扰RNA转染实验敲降差异基因,探究敲降后基因表达变化情况。3、通过ChIP-qPCR实验免疫共沉淀差异基因富集区域DNA片段,采用RT-qPCR定量DNA表达量,进一步验证差异基因间的调控关系。【结果】1、验证体外诱导重编程的SMA-iPSCs具有多能性和体内外分化能力。成功在体外建立正常和SMA病人的iPSCs向神经祖细胞分化的体系,神经祖细胞标志物PAX6、SOX1、NESTIN表达上调。2、转录组测序发现SMA疾病体外神经祖细胞分化过程中的原钙黏蛋白亚基因PCDHα6的选择性表达异常升高,这可能是神经细胞功能异常的主要原因之一。3、PCDHα6异常上调的主要原因是染色质环的重要亚基RAD21表达上调,转染siRNA敲降RAD21后,PCDHα6表达下调。表明SMA神经祖细胞中RAD21的异常增高导致了PCDHα6的异常高表达。4、机制方面,我们发现在SMA神经祖细胞分化过程中,RAD21在PCDHα6的启动子及其增强子HS5-1a区域的富集程度显著增高于正常组,说明RAD21通过调控PCDHα6启动子和增强子活性来调控其表达水平。【结论】SMA疾病iPSCs向神经祖细胞分化过程中,染色质环(Cohesin复合体)的重要亚基RAD21表达异常增多,在原钙黏蛋白PCDHα6亚基因启动子及增强子处的富集上调,将远端增强子拉向PCDHα6启动子并增强其表达活性,引起SMA神经祖细胞中PCDHα6表达异常上调,这可能是导致SMA神经祖细胞功能失调的原因。

关键词：原钙黏蛋白 SMA 神经祖细胞 RAD21 诱导多能干细胞

神经祖细胞与纤维蛋白支撑物移植对老年痴呆模型鼠的记忆认知功能改善及其机理探究

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中华细胞与干细胞杂志（电子版） 2018年第1期8卷 22-28页

作者：刘延明王伟魏传飞陈清法韩发彬青岛大学生命科学学院 266071 聊城大学/聊城市人民医院组织工程与再生医学研究所 252000

目的探讨阿尔茨海默病(AD)模型鼠双侧海马区移植含多因子孵育的神经祖细胞(NPCs)后记忆认知功能改善情况及NPCs移植后迁移定位和分化能力。方法取胎龄10 d的C57BL/6J孕鼠,分离得胎鼠NPCs,NPCs体外分化及鉴定,AD模型鼠分3组:NPCs+因子组... 详细信息

目的探讨阿尔茨海默病(AD)模型鼠双侧海马区移植含多因子孵育的神经祖细胞(NPCs)后记忆认知功能改善情况及NPCs移植后迁移定位和分化能力。方法取胎龄10 d的C57BL/6J孕鼠,分离得胎鼠NPCs,NPCs体外分化及鉴定,AD模型鼠分3组:NPCs+因子组、因子组及PBS组,对照组为同月龄C57BL/6J小鼠;Morris水迷宫及新物体识别实验检测AD模型鼠移植NPCs细胞前,及移植1至6个月后记忆行为变化情况;通过免疫荧光,免疫组化和Western-blot检测海马区移植的NPCs向神经元和胆碱能神经元分化及迁移能力。组间比较采用F检验。结果 Morris水迷宫实验中,NPCs+因子组找到平台前的逃避潜伏期时间(14.12±7.45)s要明显低于注射PBS的AD模型鼠组[(39.65±4.64)s,F=2.578,P=0.0094],因子组时间(15.68±5.34)s同样低于PBS组[(39.65±4.64)s,F=1.324,P=0.0016],24 h撤去平台后,NPCs+因子组逃避潜伏期时间(15.12±3.52)s仍低于PBS组[(37.17±2.18)s,F=2.598,P=0.0003],因子组时间(16.62±3.23)s同样低于PBS组[(37.17±2.18)s,F=2.186,P=0.0004)];新物体识别实验中,各实验组对新物体探究时间占总探究时间百分比结果中,NPCs+因子组(68.46±2.4)﹪要高于PBS组[(54.47±4.79)﹪,F=3.983,P=0.018],因子组(65.20±1.03)﹪同样高于PBS组[(54.47±4.79)﹪,F=21.63,P=0.042];实验结果表明,通过移植细胞与因子AD模型鼠的记忆认知功能在早期均得到改善,随着时间的增长,移植NPCs组的记忆改善情况持续时间更长久;Western blot结果显示AD模型鼠海马区胆碱能神经元与正常C57BL/6J鼠相比表达减少,移植NPCs后,AD模型鼠脑内胆碱能神经元增多;免疫荧光与免疫组化结果显示,移植的NPCs在AD模型鼠脑内移植区存活,并向胆碱能神经元分化。结论AD模型鼠双侧海马区移植的含多因子孵育的NPCs,通过分化成功能性的胆碱能神经元来改善AD鼠的记忆认知功能。

关键词：老年痴呆症神经祖细胞纤维蛋白胆碱能神经元动物模型细胞移植

MIF调控人胚胎干细胞向腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞分化的研究

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MIF调控人胚胎干细胞向腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞分化的研究

作者：高仕君海南医学院

学位级别：硕士

目的:在“双SMAD通道抑制剂”分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂ISO-1,观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞分化结果的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径... 详细信息

目的:在“双SMAD通道抑制剂”分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂ISO-1,观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞分化结果的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径,丰富干细胞分化理论。方法:1、添加MIF和ISO-1干预人胚胎干细胞分化整个研究分为未干预组、MIF组和ISO-1组。本研究在“双SMAD通道抑制剂”分化方案的基础上,加入3 ng/m L、10 ng/m L和30 ng/m L浓度的MIF和0.2μM、0.6μM、1.8μM浓度的ISO-1,将人胚胎干细胞定向诱导分化成DA能神经祖细胞。分化周期为16天,从诱导开始,采用N2基础培养基。在分化的前8天,加入0.8μM CHIR99021、10μM SB431542、10μM Y-27632、100 ng/m L Noggin和400 ng/m L SHH-C24II,协同促进人胚胎干细胞往中脑的腹侧和尾侧分化,同时加入MIF和ISO-1进行干预。在分化的第9天,添加100 ng/m L FGF8b。从分化的第11天开始,改用B27基础培养基,加入10μM Y-27632、100 ng/m L FGF8b、0.2m M L-抗坏血酸和20 ng/m L BDNF,协同促进分化的人胚胎干细胞朝中脑黑质多巴胺能祖细胞进行区域化与定型。2、细胞样本的检测1)采用细胞免疫荧光,从蛋白方面检测检测MIF相关因子,包括MIF、CD44、CD74和CXCR7在人胚胎干细胞的表达情况。2)采用光学显微镜,从形态学方面分析MIF和ISO-1对人胚胎干细胞分化为中脑DA能神经祖细胞的影响。3)采用实时荧光定量聚合酶链式反应,检测包括中脑标记物LIM同源盒转录因子1A（LMX1A）、同源盒基因EN1（EN1）、叉头框转录因子A2（FOXA2）;中脑与前脑共同标记物Orthodenticle同源框2（OTX2）;前脑标记物叉头框转录因子G1（FOXG1）;后脑标记物异型框基因A2（HOXA2）;神经上皮质标记物配对框6（PAX6）;STN神经元标记物BARH同源框1（BARHL1）。在基因表达水平上分析MIF和ISO-1对人胚胎干细胞分化为中脑DA能神经祖细胞的影响。通过统计学软件SPSS来做分析,若P＜0.05则有显著性差异。4)采用细胞免疫荧光以及蛋白免疫印迹法的实验检测方法,从中脑标记物LMXIA、EN1、FOXA2;中脑与前脑共同标记物OTX2;前脑标记物FOXG1;后脑标记物HOXA2;神经上皮质标记物PAX6;STN神经元标记物BARHL1等相关因子。从蛋白表达水平方面来分析MIF和ISO-1对人胚胎干细胞分化为中脑DA能神经祖细胞的影响。通过统计学软件SPSS来做分析,若P＜0.05则有显著性差异。结果:1)免疫荧光结果显示,可见大量MIF+/CD44+/CXCR7+的人胚胎干细胞,接近100%,但人胚胎干细胞不表达CD74。2)在形态学方面,人胚胎干细胞从典型的干细胞形态逐步变化成为神经祖细胞的形态:人胚胎干细胞的外观似铺路石,核质比高,细胞核较大,细胞质较少,细胞突起较短,细胞的大小较为平均,聚集生长,融合成片;神经诱导开始后,细胞形态逐渐改变为梭形,核质比逐渐发生变化,细胞质含量增加,伸出较长的突起,细胞形状变小变圆,胞间间隙日益紧密。MIF和ISO-1干预组的细胞在生长速度和形态学改变上与正常分化组相似;通过MIF和ISO-1调控的干预组未见明显的形态学差异。3)细胞免疫荧光结果显示,在分化的第16天,我们可以看到大量LMX1+/FOXA2+/EN1+/OTX2+的腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞,未干预组对腹侧以及中脑有效区域的转化率约为43%,而MIF组的转化率是对照组的1.8倍,ISO-1组的转化率是对照组的1.6倍。4)蛋白免疫印迹（Western Blot）结果显示,与未分化组相比,MIF 30 ng组可见LMX1A/FOXA2/EN1呈高水平表达,而BARHL1/HOXA2/FOXG1的表达较低（P＜0.05）;ISO-1 0.2μM组可见FOXA2/SOX6的表达较高,而BARHL1/PAX6/FOXG1呈低水平表达（P＜0.05）。5)实时荧光定量PCR（q PCR）结果显示,与未分化组相比,MIF 30 ng组可见LMX1A/FOXA2的高表达以及FOXG1/PAX6的低表达（P＜0.05）,ISO-1 0.2μM组可见FOXA2/SOX6的高表达和PAX6/LMXIA/FOXA2的低表达（P＜0.05）。结论:1.人胚胎干细胞分泌MIF,MIF以自分泌的形式分泌到培养基内,参与干细胞的分化。2.运用“双SMAD通道抑制剂”分化方案对人胚胎干细胞进行神经诱导。MIF干预后,对细胞神经诱导过程中的形态学改变、增殖与存活没有影响,可以成功诱导位于中脑底板起源的多巴胺能神经祖细胞与多巴胺能

关键词：人胚胎干细胞帕金森病神经祖细胞多巴胺能神经元诱导

小鼠胚胎干细胞分化过程中通过Pax6-GFP报告基因系统高效获得神经祖细胞的研究

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小鼠胚胎干细胞分化过程中通过Pax6-GFP报告基因系统高效获得神经...

作者：李艳妮南开大学

学位级别：硕士

神经类退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症能毁灭性地影响患者的运动能力或记忆功能,给亲属及其社会造成了巨大的负担,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合适的细胞或动物模型进行药物治疗研究。小鼠胚... 详细信息

神经类退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症能毁灭性地影响患者的运动能力或记忆功能,给亲属及其社会造成了巨大的负担,且目前尚未有可行的治愈方案,主要原因在于缺乏合适的细胞或动物模型进行药物治疗研究。小鼠胚胎干细胞（mESCs）因其具有能分化成三个胚层细胞的多能性且不存在伦理问题而被广泛运用在各个研究领域。然而,体外mESCs的谱系特化是不同步且难以控制的,就神经谱系的特化而言,目前尚没有一个严格的标准用于指示mESCs的神经分化。神经祖细胞（NPCs）是指可以分化到多种神经元的神经前体细胞,是mESCs分化到神经元的中间态细胞,它既可以通过分离早期胚胎的大脑组织获得,也可以利用ESCs进行体外分化获得,其在临床细胞替代性治疗方面有很大的应用前景。目前,在小鼠ESCs分化到NPCs的过程中,除实时观察细胞表型变化外,没有一个科学的系统行之有效地指示分化的进程,并且体外分化周期长,效率较低,导致最终获得的NPCs细胞数量不足以达到细胞替代治疗的需求,其根本原因还在于调控小鼠ESCs进行神经分化的分子机制尚不明确。因此,亟需一种高效和严谨的系统直观地对小鼠ESCs神经分化进程进行评估,进而推进神经分化、细胞替代治疗和药物筛选的研究。在本研究中,我们通过CRISPR/Cas9技术开发了一个内源性荧光标记的mESCs报告系统。在该系统中,Pax6基因后插入了一个GFP基因,使其共享同一启动子,故而能可视化地追踪神经分化过程。通过改进基于拟胚体介导分化的方法,在经过7天的分化后,我们可以通过流式分选技术高效地富集到NPCs。因此,我们建立了一种更简便、更快捷的方法富集到高纯度、多潜能的可进一步分化为功能性神经元的NPCs。该系统可作为一种理想的工具细胞运用于大规模神经分化相关基因和药物的筛选研究,为神经科学的研究铺平道路。

关键词：神经祖细胞胚胎干细胞神经分化报告系统流式分选

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糖皮质激素对成体海马神经祖细胞的影响

中国组织工程研究 2013年第19期17卷 3521-3526页

作者：于秀军李奕台立稳陈相河北医科大学第二医院神经内科神经病学河北省重点实验室河北省石家庄市050000

背景:体内研究显示,高浓度糖皮质激素可抑制大鼠内源性神经前体细胞增殖。而神经胶质抗原2蛋白聚糖阳性神经祖细胞(NG2细胞)是成熟中枢神经系统中最大的增殖细胞群体,具有多分化潜能。目的:观察糖皮质激素对体外培养的成熟大鼠海马由来... 详细信息

背景:体内研究显示,高浓度糖皮质激素可抑制大鼠内源性神经前体细胞增殖。而神经胶质抗原2蛋白聚糖阳性神经祖细胞(NG2细胞)是成熟中枢神经系统中最大的增殖细胞群体,具有多分化潜能。目的:观察糖皮质激素对体外培养的成熟大鼠海马由来的NG2细胞生存和增殖的影响。方法:原代及传代培养成年大鼠海马NG2细胞,以0,0.1,1,10,100μmol浓度糖皮质激素类药物地塞米松干预48h后,采用乳酸脱氢酶分析法测定细胞活性,原位缺口末端标记技术(即TUNEL法)观察细胞凋亡情况,5’-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法鉴定细胞增殖状况。结果与结论:1,10,100μmol浓度地塞米松干预明显减少NG2细胞数,并显著增加TUNEL阳性细胞率,明显减少BrdU阳性细胞率。结果可见高浓度糖皮质激素能抑制NG2细胞分裂增殖,并诱导细胞凋亡,从而明显减少NG2细胞数。

关键词：干细胞干细胞培养与分化糖皮质激素神经胶质抗原2 神经祖细胞增殖凋亡应激地塞米松海马原代培养神经发生省级基金

脑蛋白水解物注射液对培养神经胶质抗原2阳性神经祖细胞的影响

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中国组织工程研究 2013年第6期17卷 1081-1088页

作者：于秀军李奕温迪河北医科大学第二医院神经内科神经病学河北省重点实验室河北省石家庄市050000

背景:脑蛋白水解物注射液能缓解多种神经系统疾病的症状,但其作用机制并不明确。研究显示,脑蛋白水解物注射液在体内和体外实验中有促进神经发生的潜能。目的:观察脑蛋白水解物注射液对培养的神经胶质抗原2阳性神经祖细胞增殖和分化的... 详细信息

背景:脑蛋白水解物注射液能缓解多种神经系统疾病的症状,但其作用机制并不明确。研究显示,脑蛋白水解物注射液在体内和体外实验中有促进神经发生的潜能。目的:观察脑蛋白水解物注射液对培养的神经胶质抗原2阳性神经祖细胞增殖和分化的影响。方法:取成年大鼠海马原代及传代培养神经胶质抗原2细胞,以免疫荧光染色法鉴定细胞性质,以乳酸脱氢酶分析法测定细胞活性,以原位缺口末端标记技术(即TUNEL法)观察细胞凋亡,BrdU掺入法鉴定新生细胞。结果与结论:脑蛋白水解物注射液干预显著减少TUNEL阳性细胞数,并明显增加神经胶质抗原2细胞数和神经胶质抗原2细胞中微管相关蛋白2a+2b、突触蛋白Ⅰ、γ-氨基丁酸和囊泡γ-氨基丁酸转运体表达水平。说明脑蛋白水解物注射液能抑制神经胶质抗原2细胞凋亡,促进神经胶质抗原2细胞增殖,并能促进神经胶质抗原2细胞向神经元(特别是γ-氨基丁酸能抑制性中间神经元)分化。

关键词：干细胞干细胞培养与分化脑蛋白水解物注射液神经胶质抗原2 神经祖细胞增殖分化乳酸脱氢酶微管相关蛋白2a+2b γ-氨基丁酸囊泡 γ-氨基丁酸转运体省级基金干细胞图片文章

光遗传调控SOCE通路诱导NFATcl与NFATc3活化在神经祖细胞分化调控中作用机制的研究

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光遗传调控SOCE通路诱导NFATcl与NFATc3活化在神经祖细胞分化调控...

作者：马腾中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

神经祖细胞(Neural Progenitor Cell,NPCs)是中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)中一种特殊类型的专能干细胞,具有自我更新和定向分化为星型胶质细胞(Astrocyte,Ast),少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)和神经元(Neuron,Neo)的能力。NPCs不仅作为哺乳动物CNS发育早期的神经发生细胞,在成熟的CNS中,NPCs也可作为后备存储细胞,少量的储存在成体脑组织的特定区域内。当CNS受到损伤或疾病刺激而发生不可逆转的细胞死亡和缺失后,NPCs被重新激活,参与细胞和组织的损伤修复过程。基于这种特性,临床上已经应用体外培养的NPCs移植来治疗CNS损伤。然而,在自然分化的条件下,仅有约15%的NPCs向Neo分化,约10%的NPCs向OL分化,绝大部分约75%的NPCs向Ast方向分化。在这种不平衡的分化比例下,不仅过多Ast会形成胶质瘢痕而阻碍损伤的修复,Neo和OL分化比例过低也会严重限制神经功能的恢复。因此,如何诱导NPCs定向OL或者Neo分化目前NPCs研究领域中亟待解决的难题。研究发现NPCs的分化调控可以概括为外部信号和内部信号两个主要方面。而NPCs内部转录因子的表达水平被发现在NPCs定向分化中发挥了决定性作用,过表达Mash1/Olig2/Hes1三种重要的转录因子在NPCs中的表达能够直接促进NPCs向Neo/OL/Ast的定向分化。这提示我们NPCs的定向分化调控是可以通过调转录因子的表达水平来实现。活化的T细胞核内转录因子(Nuclear factor of activated T cells,NFAT)是一大类转录因子家族,包括NFATc1—c5五种亚型。目前研究发现NFAT家族的功能不仅仅局限于免疫系统中,同时也广泛调控着CNS中重要的生理过程,如:神经发生,神经细胞分化等。Tranque等人通过药理阻断NFAT蛋白功能后,发现NPCs的增殖、迁移、分化均等功能受到显著的影响;Wegner等人报道了NFAT转录因子在OL细胞系中表达下调会抑制Olig2的表达,阻碍OL的分化过程。这说明NFAT转录因子家族可能在NPCs中广泛参与了重要细胞功能的调控,甚至调控着Olig2的表达,从而参与了NPCs向OL的分化过程。然而目前探究NFAT信号在NPCs定向分化中的研究报道非常少,这一假设需要进一步的实验证据支持。不仅如此,NFAT信号的活化和关闭具有明显的钙离子(Calcium,[Ca])依赖性和可调控性。在细胞处于静息状态时,磷酸化的NFAT蛋白富集于细胞浆内。而在刺激作用后,细胞浆内[Ca]浓度快速升高,诱导钙调素(Calmodulin,CaM)的活化,从而激活下游钙调蛋白(Calcineurin,CaN)使NFAT蛋白发生去磷酸化。去磷酸化后NFAT蛋白入核并与DNA序列结合从而发挥调控作用。值得注意的是,NFAT信号核转位的维持需要连续的[Ca]信号刺激,当细胞内的[Ca]水平下降时,NFAT蛋白会迅速的被重新磷酸化而转运出细胞核。因此,NFAT转录因子功能的发挥不仅与细胞浆内[Ca]浓度密切相关,更需要持续的高浓度的[Ca]信号刺激。研究发现,钙库操纵性钙离子内流(Store—operated Caentry,SOCE)是非兴奋细胞中胞内[Ca]升高的主要方式之一。SOCE通路目前已明确是由两个主要的蛋白质家族构成,即位于内质网上STIM蛋白和位于细胞膜上的Orai蛋白。Nieswandt等人发现当小鼠胸腺T细胞内的STIM蛋白被敲除后,NFAT信号通路显著减弱甚至消失。这提示我们SOCE通路所介导的[Ca]升高是NFAT信号激活的主要源头,并且理论上通过调控SOCE通路在NPCs中的开放与关闭,可以间接的实现对其下游[Ca]/CaN/NFAT信号通路的精确调控。不仅如此,通过调控SOCE/NFAT通路能否实时调控NPCs的分化启动和命运决定,这些假设值得进一步的探究。本研究结合最新的光遗传学技术,即在NPCs稳定表达光敏感的SOCE通路蛋白,利用470nm波长蓝光照射(Blue Light Stimulation,BLS)来实时、精确的调控SOCE通路在NPCs中的开放与关闭。随后通过Fluo-3检测胞内[Ca]水平,PCR、ICC等方法检测BLS刺激后SOCE通路开放及NFAT信号核转位情况。最后通过ICC检测BLS刺激后,NPCs分化情况以及NFAT亚型不同的调控功能。本研究期望通过光遗传技术构建体外实时调控NPCs定向分化的细胞模型同时为NFAT通路在NPCs定向分化中的重要作用提供实验依据。本实验分为四个部分:第一部分光遗传质粒rLOVsoc病毒质粒的构建与鉴定,体外NPCs转染效率评定光遗传LOVsoc原始质粒由Yubin Zhou教授赠送(Addgene,#101245),其质粒结构为pTri

关键词：神经祖细胞钙离子 NFAT 分化凋亡

内皮细胞分泌的外泌体增强神经祖细胞活性并在急性MCAO中促进神经修复的研究

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内皮细胞分泌的外泌体增强神经祖细胞活性并在急性MCAO中促进神经...

作者：周少婷皖南医学院

学位级别：硕士

目的:相关研究证实,外泌体参与细胞间通讯并调控靶细胞的相关行为。数据表明,脑微血管内皮细胞可分泌外泌体。因此,本研究旨在进一步探讨内皮细胞外泌体对神经祖细胞生存活性的影响,并在MCAO模型中进一步验证,从而为卒中后损伤区神经功... 详细信息

目的:相关研究证实,外泌体参与细胞间通讯并调控靶细胞的相关行为。数据表明,脑微血管内皮细胞可分泌外泌体。因此,本研究旨在进一步探讨内皮细胞外泌体对神经祖细胞生存活性的影响,并在MCAO模型中进一步验证,从而为卒中后损伤区神经功能重建提供新的思路及潜在的临床治疗手段。方法:1.分离培养野生型小鼠的神经祖细胞(NPC),用干细胞专用培养基对其进行培养,待纯化后利用免疫荧光法鉴定其表面特异性抗原。2.用超速离心的方法提取鼠源微血管内皮细胞(bEnd.3)的外泌体,并通过透射电镜,Western blot,动态光散射进行鉴定,分别使用不同浓度培养NPCs,利用CCK8试剂,Edu试剂盒检测其对NPCs增殖能力的影响;利用Trans-well,细胞划痕实验检测外泌体对NPCs迁移能力的作用;在营养因子剥夺的环境中,外泌体处理3h通过FACS/PI检测其对NPCs细胞凋亡的影响,采用Western blot进一步检测各类凋亡蛋白的表达情况。3.MCAO造模成功后,通过颅内立体定位仪在侧脑室注射100uL,100ug/mL的外泌体或PBS,分别在第1,3,7,14,21天进行行为学的评定,第1天和21天通过颅脑磁共振检测动物的病变情况,并分别统计脑梗死体积。结果:神经祖细胞特异性抗体Sox2、Nestin双标成功鉴定提取的细胞;通过Edu,Dapi染色证明了内皮细胞可促进神经祖细胞的增殖和迁移,且与内皮细胞的数量成正比。透射电镜下外泌体形态为椭圆形或圆形,直径大小为30-150nm。Western Blot检测显示内皮细胞培养上清液和外泌体TSG101、Alix、Flotillin-2蛋白均表达阳性。动态光散射分析分离所得细胞外囊泡大小分布均在30-200nm范围内。在加入的外泌体浓度为60ug/mL的条件培养基中,明显能促进NPCs的增殖和迁移,并抑制其凋亡。通过TTC染色确定MCAO模型构建成功,磁共振结果显示造模后第1天和21天颅内立体定位注射外泌体组的动物比注射PBS组的动物脑梗死体积有所减小,catwalk评估显示外泌体组的动物比PBS组的动物行为学结果要好。结论:内皮细胞的外泌体具有促进神经祖细胞的增殖和迁移,并抑制其凋亡的功能,并且在大脑中动脉闭塞模型中验证内皮细胞的外泌体可改善脑梗死后动物的神经功能修复,这可能是一种潜在的临床治疗手段。

关键词：外泌体神经祖细胞 MCAO 细胞间通讯缺血性脑卒中