MIF调控人胚胎干细胞向腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞分化的研究

作     者：高仕君 

作者单位：海南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陈志斌

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：人胚胎干细胞 帕金森病 神经祖细胞 多巴胺能神经元 诱导 

摘      要：目的:在“双SMAD通道抑制剂分化方案的基础上,通过在培养基中添加不同浓度MIF及其抑制剂ISO-1,观察其对人胚胎干细胞分化为中脑多巴胺能祖细胞分化结果的影响,以期寻找解决人胚胎干细胞分化中脑多巴胺能祖细胞过程异质性问题的新途径,丰富干细胞分化理论。方法:1、添加MIF和ISO-1干预人胚胎干细胞分化整个研究分为未干预组、MIF组和ISO-1组。本研究在“双SMAD通道抑制剂分化方案的基础上,加入3 ng/m L、10 ng/m L和30 ng/m L浓度的MIF和0.2μM、0.6μM、1.8μM浓度的ISO-1,将人胚胎干细胞定向诱导分化成DA能神经祖细胞。分化周期为16天,从诱导开始,采用N2基础培养基。在分化的前8天,加入0.8μM CHIR99021、10μM SB431542、10μM Y-27632、100 ng/m L Noggin和400 ng/m L SHH-C24II,协同促进人胚胎干细胞往中脑的腹侧和尾侧分化,同时加入MIF和ISO-1进行干预。在分化的第9天,添加100 ng/m L FGF8b。从分化的第11天开始,改用B27基础培养基,加入10μM Y-27632、100 ng/m L FGF8b、0.2m M L-抗坏血酸和20 ng/m L BDNF,协同促进分化的人胚胎干细胞朝中脑黑质多巴胺能祖细胞进行区域化与定型。2、细胞样本的检测1)采用细胞免疫荧光,从蛋白方面检测检测MIF相关因子,包括MIF、CD44、CD74和CXCR7在人胚胎干细胞的表达情况。2)采用光学显微镜,从形态学方面分析MIF和ISO-1对人胚胎干细胞分化为中脑DA能神经祖细胞的影响。3)采用实时荧光定量聚合酶链式反应,检测包括中脑标记物LIM同源盒转录因子1A（LMX1A）、同源盒基因EN1（EN1）、叉头框转录因子A2（FOXA2）;中脑与前脑共同标记物Orthodenticle同源框2（OTX2）;前脑标记物叉头框转录因子G1（FOXG1）;后脑标记物异型框基因A2（HOXA2）;神经上皮质标记物配对框6（PAX6）;STN神经元标记物BARH同源框1（BARHL1）。在基因表达水平上分析MIF和ISO-1对人胚胎干细胞分化为中脑DA能神经祖细胞的影响。通过统计学软件SPSS来做分析,若P0.05则有显著性差异。4)采用细胞免疫荧光以及蛋白免疫印迹法的实验检测方法,从中脑标记物LMXIA、EN1、FOXA2;中脑与前脑共同标记物OTX2;前脑标记物FOXG1;后脑标记物HOXA2;神经上皮质标记物PAX6;STN神经元标记物BARHL1等相关因子。从蛋白表达水平方面来分析MIF和ISO-1对人胚胎干细胞分化为中脑DA能神经祖细胞的影响。通过统计学软件SPSS来做分析,若P0.05则有显著性差异。结果:1)免疫荧光结果显示,可见大量MIF+/CD44+/CXCR7+的人胚胎干细胞,接近100%,但人胚胎干细胞不表达CD74。2)在形态学方面,人胚胎干细胞从典型的干细胞形态逐步变化成为神经祖细胞的形态:人胚胎干细胞的外观似铺路石,核质比高,细胞核较大,细胞质较少,细胞突起较短,细胞的大小较为平均,聚集生长,融合成片;神经诱导开始后,细胞形态逐渐改变为梭形,核质比逐渐发生变化,细胞质含量增加,伸出较长的突起,细胞形状变小变圆,胞间间隙日益紧密。MIF和ISO-1干预组的细胞在生长速度和形态学改变上与正常分化组相似;通过MIF和ISO-1调控的干预组未见明显的形态学差异。3)细胞免疫荧光结果显示,在分化的第16天,我们可以看到大量LMX1+/FOXA2+/EN1+/OTX2+的腹侧中脑多巴胺能神经祖细胞,未干预组对腹侧以及中脑有效区域的转化率约为43%,而MIF组的转化率是对照组的1.8倍,ISO-1组的转化率是对照组的1.6倍。4)蛋白免疫印迹（Western Blot）结果显示,与未分化组相比,MIF 30 ng组可见LMX1A/FOXA2/EN1呈高水平表达,而BARHL1/HOXA2/FOXG1的表达较低（P0.05）;ISO-1 0.2μM组可见FOXA2/SOX6的表达较高,而BARHL1/PAX6/FOXG1呈低水平表达（P0.05）。5)实时荧光定量PCR（q PCR）结果显示,与未分化组相比,MIF 30 ng组可见LMX1A/FOXA2的高表达以及FOXG1/PAX6的低表达（P0.05）,ISO-1 0.2μM组可见FOXA2/SOX6的高表达和PAX6/LMXIA/FOXA2的低表达（P0.05）。结论:1.人胚胎干细胞分泌MIF,MIF以自分泌的形式分泌到培养基内,参与干细胞的分化。2.运用“双SMAD通道抑制剂分化方案对人胚胎干细胞进行神经诱导。MIF干预后,对细胞神经诱导过程中的形态学改变、增殖与存活没有影响,可以成功诱导位于中脑底板起源的多巴胺能神经祖细胞与多巴胺能神经元,在一定的浓度区间内让分化的祖细胞更集中于中脑区域,并抑制了前脑和后脑等杂细胞的表达,且无浓度依赖性。3.MIF在h ESCs的多巴胺能分化潜能与腹侧中脑命运决定中起着重要作用,MIF的干预进一步优化了神经诱导的区域定位,加速该方案向临床转化。但是ISO-1干预后高表达SOX6并抑制了EN1的机制还有待研究。