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人胚胎干细胞与急性早幼粒细胞白血病细胞的拉曼光谱特征研究

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光谱学与光谱分析 2020年第1期40卷 1-9页

作者：梁昊岳程雪莲杨晚竹于文颖李长虹董树旭赵轼轩茹永新中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)实验血液学国家重点实验室国家血液病临床学研究中心

急性早幼粒细胞白血病(APL)属于急性髓系白血病(AML),是FAB分型中的M3亚型。部分APL患者形成早幼粒细胞白血病/维甲酸受体融合基因,即PML-RARα融合基因。在内外界多种因素的共同作用下,早幼粒细胞白血病发病。胚胎干细胞(ESCs)具有多... 详细信息

急性早幼粒细胞白血病(APL)属于急性髓系白血病(AML),是FAB分型中的M3亚型。部分APL患者形成早幼粒细胞白血病/维甲酸受体融合基因,即PML-RARα融合基因。在内外界多种因素的共同作用下,早幼粒细胞白血病发病。胚胎干细胞(ESCs)具有多向分化的能力,在一定诱导条件下, ESCs可以向造血系统分化。早幼粒细胞位于ESCs分化下游,为粒系分化阶段的一种细胞。探索一种非标记的技术方法鉴别不同分化阶段造血细胞具有重要的科研和实践意义。拉曼光谱技术可用于多种类型疾病的鉴别诊断研究,近年来应用前景愈加广阔。实验研究人胚胎干细胞系(ES)、急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和急性早幼粒细胞白血病患者(M3)白血病细胞的拉曼光谱特征,建立拉曼光谱非标记鉴别不同分化阶段白血病的方法,为临床实验研究提供基础。分别收集胚胎干细胞系(ES)、急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和4例M3患者白血病细胞,使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱,每组或每例患者采集25~30个白血病细胞光谱。结合应用主成分分析法(PCA)、判别函数分析(DFA)、系统聚类分析和偏最小二乘判别分析(PLS-DA),对三类细胞的光谱进行分析并建立模型,进而对三类细胞进行鉴别,应用交互验证法对模型进行验证。同时结合细胞超微结构分析三种细胞的拉曼光谱特征。M3, NB4和ES细胞的拉曼光谱差别显著,主要表现为M3和NB4细胞光谱中对应核酸、蛋白质及脂类物质的谱峰明显高于ES细胞,其生物学机制包含了APL与PI3K/Akt/mTOR通路的密切关系。PI3K/Akt/mTOR通路在急性早幼粒细胞白血病细胞中存在异常激活,影响白血病细胞的生物大分子代谢;鉴别建模的总体分类准确率达100%(181/181),交互验证的分类准确率达98.9%(179/181),表明鉴别模型预测能力良好。拉曼光谱分析显示M3细胞和NB4细胞增殖代谢明显高于ES细胞,根据PCA-DFA、聚类分析及PLS-DA建立的拉曼光谱鉴别模型能够准确区分3种不同分化阶段白血病相关细胞,其结果与电镜结果相符。

关键词：人胚胎干细胞急性早幼粒细胞白血病拉曼光谱超微结构

人胚胎干细胞向内皮祖细胞诱导分化及其应用研究进展

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生物化学与生物物理进展 2010年第2期37卷 138-144页

作者：吴琼习佳飞李亚里裴雪涛解放军总医院妇产科北京100853 军事医学科学院输血医学研究所北京100850 解放军三O七医院妇科北京100071

近年来,内皮细胞的应用价值不断提高,应用领域不断拓宽,但其来源有限,成为研究应用的主要障碍.胚胎干细胞在体外可分化为多种组织细胞系,有可能成为获取内皮细胞的另一来源.就人胚胎干细胞向内皮祖细胞分化、分离方法、相关分子机制及... 详细信息

近年来,内皮细胞的应用价值不断提高,应用领域不断拓宽,但其来源有限,成为研究应用的主要障碍.胚胎干细胞在体外可分化为多种组织细胞系,有可能成为获取内皮细胞的另一来源.就人胚胎干细胞向内皮祖细胞分化、分离方法、相关分子机制及内皮祖细胞应用价值等进行阐述,以期能够引起更多的关注,推动其研究的进展.

关键词：人胚胎干细胞内皮祖细胞分化应用

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人胚胎干细胞多基因同时抑制系统的建立

上海交通大学学报（医学版） 2019年第5期39卷 478-486页

作者：朱超南陈沁雯辛晨歌李慧上海交通大学基础医学院组织胚胎学与遗传发育学系

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox... 详细信息

目的·在人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中构建基于CRISPR 干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法·通过Golden Gate 克隆法在hESCs 中建立受强力霉素(doxycycline,Dox)调控的多基因CRISPR 干扰系统。该系统主要由2 个质粒组成:1 个质粒在Dox 调控下融合表达核酸酶失活的CRISPR 相关蛋白9(nucleasedeactivatedCRISPR-associated protein 9,dCas9)和Krüppel 相关盒(Krüppel-associated box,KRAB)抑制结构域(dCas9-KRAB),另1 个质粒可同时表达8 个独立的导向RNA(guide RNA,gRNA)来分别引导dCas9-KRAB 蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸。以基因组DNA 为模板进行PCR,确定2 个质粒是否整合至细胞基因组,并通过Western blotting 确定细胞在Dox 诱导下是否可表达dCas9-KRAB 蛋白。结果·使用这种可调控的多基因CRISPR 干扰系统,可在Dox 诱导下在hESCs 中同时成功抑制多个基因的表达;并且这些基因的表达被抑制导致hESCs 形态改变,碱性磷酸酶活性下降,hESCs 表面标志物阶段特异性胚胎表面抗原4(stagespecificembryonic antigen 4,SSEA4)的表达下降,hESCs 发生分化。结论·该CRISPR 干扰系统可以在hESCs 中高效地同时抑制多个基因的表达,是十分有效的多基因研究工具。

关键词： CRISPR干扰系统可诱导的多基因同时抑制 GoldenGate克隆法人胚胎干细胞

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

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上海交通大学学报（医学版） 2009年第3期29卷 307-311页

作者：石伦刚唐郑雅陆峻泓曹谊林张文杰上海交通大学医学院第九人民医院整复外科上海组织工程国家工程研究中心上海200011

目的建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性。方法人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展... 详细信息

目的建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性。方法人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增。观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析。取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力。结果诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变。免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin)。流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志。特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强。结论成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化。分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能。

关键词：人胚胎干细胞间充质干细胞诱导分化

人胚胎干细胞在药源性心脏和肝毒性研究中的应用进展

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中国药理学与毒理学杂志 2014年第4期28卷 612-617页

作者：王淑颜汪溪洁胡晓敏马璟中国医药工业研究总院上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心上海201203 国家食品药品监督管理局药品审评中心北京100038

人胚胎干细胞(hESC)具有无限增殖和诱导分化为心肌细胞和肝细胞的能力,可应用于新药筛选和药物的安全性评价过程。心脏毒性和肝毒性是新药研发失败、被监管以及撤市的主要原因。hESC分化的心肌细胞和肝细胞具有结构和功能特性,能在体外... 详细信息

人胚胎干细胞(hESC)具有无限增殖和诱导分化为心肌细胞和肝细胞的能力,可应用于新药筛选和药物的安全性评价过程。心脏毒性和肝毒性是新药研发失败、被监管以及撤市的主要原因。hESC分化的心肌细胞和肝细胞具有结构和功能特性,能在体外模拟药物的心脏和肝毒性,且基于hESC诱导分化的心肌细胞和肝细胞建立的体外新药安全评价系统,具有实验周期短、用药量少、成本低和有效避免种属差异等优点。因此,hESC分化的心肌和肝细胞在药物毒理学研究中具有广阔的应用前景。

关键词：人胚胎干细胞心脏毒性肝毒性安全性评价

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人胚胎干细胞建系的研究现状与存在的问题

生物工程学报 2002年第2期18卷 131-135页

作者：孟国良尚克刚丁明孝北京大学生命科学学院北京100871

人胚胎干细胞系的建立 ,对人类胚胎发生和人类发育生物学研究、人类新基因的发现和功能研究以及基因治疗、细胞和组织的移植治疗等领域的突破性进展具有重大意义 ;回顾了人胚胎干细胞建系研究的历程 ,就建系的几种方案、路线、意义和可... 详细信息

人胚胎干细胞系的建立 ,对人类胚胎发生和人类发育生物学研究、人类新基因的发现和功能研究以及基因治疗、细胞和组织的移植治疗等领域的突破性进展具有重大意义 ;回顾了人胚胎干细胞建系研究的历程 ,就建系的几种方案、路线、意义和可行性进行了探讨 ;详细系统地说明了迄今为止建立人胚胎干细胞系所需要的饲养层类型、培养基组成、添加细胞因子种类及其作用 ;分析了建立和维持人胚胎干细胞系所需消化酶的种类及其作用以及目前常用的几种传代方法 ;从若干方面总结了人胚胎干细胞系的鉴定方法 ,并对建立和维持人胚胎干细胞系中存在的若干问题进行了剖析。

关键词：人胚胎干细胞人胚胎生殖细胞多能性分化端粒酶

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人胚胎干细胞源多巴胺能神经元的功能性分化

中国组织工程研究 2017年第33期21卷 5360-5368页

作者：彭雅南胡兰王埮李科杨柳陈丽陈小武陈志斌赵振强海南医学院第一附属医院神经内科海南省海口市570102 海南医学院第一附属医院检验科海南省海口市570102 海南医学院第一附属医院眼科海南省海口市570102

背景:干细胞源多巴胺能神经元作为帕金森病替代疗法的细胞来源,其体外分化方案被不断的优化和改良,后续的鉴定手段和检测指标也随之不断完善。目的:通过观察人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元的形态发育过程,检测其电生理特性,以了解在... 详细信息

背景:干细胞源多巴胺能神经元作为帕金森病替代疗法的细胞来源,其体外分化方案被不断的优化和改良,后续的鉴定手段和检测指标也随之不断完善。目的:通过观察人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元的形态发育过程,检测其电生理特性,以了解在目前分化方案下人胚胎干细胞能否发育为形态成熟、功能成熟的多巴胺能神经元。方法:通过单层贴壁法,采用SMAD通道双抑制剂分化方案,定向诱导人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元,通过光镜、电镜和细胞免疫荧光等检测手段进行形态学和免疫化学鉴定,并应用膜片钳技术检测多巴胺能神经元的电生理特性。参照体内多巴胺能神经元的电生理标准,对体外分化的多巴胺能神经元进行功能评价。结果与结论:(1)采用SMAD通道双抑制剂分化方案,成功诱导人胚胎干细胞定向分化为形态学上发育成熟的多巴胺能神经元;(2)膜片钳检测结果显示多巴胺能神经元具有成熟的电生理功能,且其电生理特性符合体内多巴胺能神经元的评价标准;(3)上述分化方案可以将人胚胎干细胞定向分化为成熟的、有功能的多巴胺能神经元。

关键词：干细胞人胚胎干细胞细胞分化多巴胺能神经元帕金森病膜片钳细胞电生理国家自然科学基金

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人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

生理科学进展 2006年第1期37卷 17-21页

作者：郭新蔡志明桂耀庭北京大学深圳医院男性生殖医学实验室深圳518036

小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞,人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境(niche)方面进行综述,并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究... 详细信息

小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞,人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境(niche)方面进行综述,并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究方向和应用前景。

关键词：人胚胎干细胞生殖细胞小生境基因

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高效诱导人胚胎干细胞成为内皮祖细胞

生物化学与生物物理进展 2013年第6期40卷 548-555页

作者：房芳张博文何丽娟周军年王静雪岳文谢小燕裴雪涛军事医学科学院野战输血研究所全军干细胞与再生医学重点实验室北京100850

血管的发生和发育不仅对胚胎形成中各器官的发育分化十分重要,并且对成体的创伤修复和生殖功能也具有重要意义.血管内皮细胞是形成心血管封闭管道系统的形态基础,体外多种细胞可经诱导分化产生出内皮祖/内皮细胞(endothelialprogenitor/... 详细信息

血管的发生和发育不仅对胚胎形成中各器官的发育分化十分重要,并且对成体的创伤修复和生殖功能也具有重要意义.血管内皮细胞是形成心血管封闭管道系统的形态基础,体外多种细胞可经诱导分化产生出内皮祖/内皮细胞(endothelialprogenitor/endothelial cells,EPCs/ECs),但是存在一些不足.鉴于人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)诱导分化的全能性和长期增殖能力,为EPCs/ECs提供了新的来源.现有文献报道,hESCs诱导分化为EPCs/ECs的比例较低,为了提高该诱导分化效率,我们使用分阶段的二维诱导方法,首先将细胞接种在超纯层纤连蛋白(Matrigel)上,之后通过在不同阶段添加不同的因子,最终获得CD31+KDR+细胞的比例可以达到16%.进一步内皮诱导分化的结果显示,获得的EPCs/ECs的比例可以达到约32%,这些细胞具有在Matrigel上形成血管样结构的能力,可结合植物凝集素.实时定量PCR的结果显示,诱导分化所得的细胞表达众多内皮相关基因,并且免疫荧光的结果也表明部分细胞表达内皮细胞特异性表面标志CD31.

关键词：人胚胎干细胞内皮祖内皮细胞诱导分化