SMA患者来源iPSCs神经祖细胞分化过程中PCDHα6选择性表达异常及其调控机制研究

作     者：罗倩 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙筱放;徐志良

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：原钙黏蛋白 SMA 神经祖细胞 RAD21 诱导多能干细胞 

摘      要：【背景】脊髓性肌萎缩综合征(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是由SMN1基因突变引起SMN蛋白表达减少导致运动神经元变性和肌肉萎缩的罕见常染色体遗传病,是新生儿致死主要疾病之一。SMN蛋白下调会引起神经元轴突受损、神经肌肉接头减少、信号传导受阻。PCDH基因簇在神经发育中必不可少,具有轴突形成、树突自我回避、神经元存活等功能。PCDH亚基因选择性表达可作为神经元细胞结构及功能独特性的表面标志物。然而PCDH基因簇在运动神经元发育过程中的功能及选择表达的调控机制目前还不清楚,其在SMA疾病发病过程中变性的运动神经元细胞和萎缩的肌肉细胞中的选择性表达模式及调控机制也还有待阐明。【实验目的】通过建立SMA疾病体外神经分化模型研究原钙黏蛋白PCDH亚基因在正常及SMA神经祖细胞分化过程中的选择性表达情况,以及调控PCDH亚基因选择性表达异常的调控机制。【实验方法】1、通过免疫荧光染色、流式细胞术、RT-qPCR等实验验证SMA-iPSCs的多能性;采用畸胎瘤形成实验、EB形成实验验证其体内外分化能力。通过SMADI神经诱导培养建立iPSCs向神经祖细胞的体外分化体系;通过免疫荧光染色、RT-qPCR实验验证神经祖细胞标志物。2、通过RNA-seq测序寻找SMA疾病组与正常组细胞在体外神经分化过程中的差异基因并通过RT-qPCR实验验证。采用小干扰RNA转染实验敲降差异基因,探究敲降后基因表达变化情况。3、通过ChIP-qPCR实验免疫共沉淀差异基因富集区域DNA片段,采用RT-qPCR定量DNA表达量,进一步验证差异基因间的调控关系。【结果】1、验证体外诱导重编程的SMA-iPSCs具有多能性和体内外分化能力。成功在体外建立正常和SMA病人的iPSCs向神经祖细胞分化的体系,神经祖细胞标志物PAX6、SOX1、NESTIN表达上调。2、转录组测序发现SMA疾病体外神经祖细胞分化过程中的原钙黏蛋白亚基因PCDHα6的选择性表达异常升高,这可能是神经细胞功能异常的主要原因之一。3、PCDHα6异常上调的主要原因是染色质环的重要亚基RAD21表达上调,转染siRNA敲降RAD21后,PCDHα6表达下调。表明SMA神经祖细胞中RAD21的异常增高导致了PCDHα6的异常高表达。4、机制方面,我们发现在SMA神经祖细胞分化过程中,RAD21在PCDHα6的启动子及其增强子HS5-1a区域的富集程度显著增高于正常组,说明RAD21通过调控PCDHα6启动子和增强子活性来调控其表达水平。【结论】SMA疾病iPSCs向神经祖细胞分化过程中,染色质环(Cohesin复合体)的重要亚基RAD21表达异常增多,在原钙黏蛋白PCDHα6亚基因启动子及增强子处的富集上调,将远端增强子拉向PCDHα6启动子并增强其表达活性,引起SMA神经祖细胞中PCDHα6表达异常上调,这可能是导致SMA神经祖细胞功能失调的原因。