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免疫捕捉pcr和直接pcr技术检测单核细胞增生性李斯特菌比较研究

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食品科学 2012年第20期33卷 243-248页

作者：刘雅莉刘箐刘芳韩舜愈王婧夏俊芳汪小波樊学军田绿波兰州大学第二医院甘肃兰州730030 上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093 甘肃出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心甘肃兰州730020 甘肃农业大学食品科学与工程学院甘肃兰州730070 昌吉州疾病控制预防中心新疆昌吉831100 四川出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心四川成都610041

将免疫学技术与分子生物学技术相结合,建立了免疫捕捉pcr(IC-pcr),并与传统的直接pcr(Direct-pcr)进行比较。结果显示:纯菌液中IC-pcr检测灵敏度(104CFU/mL)是Direct-pcr灵敏度(105CFU/mL)的10倍;模拟带菌实验结果表明:IC-pcr最低可检测... 详细信息

将免疫学技术与分子生物学技术相结合,建立了免疫捕捉pcr(IC-pcr),并与传统的直接pcr(Direct-pcr)进行比较。结果显示:纯菌液中IC-pcr检测灵敏度(104CFU/mL)是Direct-pcr灵敏度(105CFU/mL)的10倍;模拟带菌实验结果表明:IC-pcr最低可检测到5×101个细菌/pcr反应体系(即104CFU/mL),检测限比Direct-pcr(5×103个细菌/pcr反应体系即106CFU/mL)高100倍;特异性实验、干扰实验结果表明IC-pcr可特异检测单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monaytogenes,LM),而和18株其他常见食源性致病菌无交叉反应。IC-pcr具有快速、经济、灵敏、特异等优点,是一种适合食品安全监管部门、食品企业的LM快速检测方法。

关键词：单核细胞增生性李斯特菌免疫捕捉pcr 直接pcr

应用直接pcr技术快速筛查转基因玉米方法研究

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玉米科学 2017年第1期25卷 29-33页

作者：邢珍娟董立明刘娜夏蔚李葱葱李飞武吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所长春130033

以转CP4-epsps基因玉米为研究对象,用玉米内标准基因z SSIIb及3种常见转基因成分(Ca MV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基因)为检测靶标,建立基于直接pcr技术的玉米转基因成分筛查方法。此方法不用提取纯化DNA,只需取直径约为0.5 mm的... 详细信息

以转CP4-epsps基因玉米为研究对象,用玉米内标准基因z SSIIb及3种常见转基因成分(Ca MV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基因)为检测靶标,建立基于直接pcr技术的玉米转基因成分筛查方法。此方法不用提取纯化DNA,只需取直径约为0.5 mm的叶片加到pcr反应体系中进行扩增,与常规pcr方法相比,在保证结果准确性的同时,大大缩短检测时间,提高工作效率。此方法具有操作简便、结果可靠等优点,适用于玉米叶片中转基因成分的快速筛查。

关键词：转基因玉米直接pcr 快速筛查

FTA卡血样快速直接pcr扩增方法比较初探

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中国法医学杂志 2014年第3期29卷 191-193页

作者：刘琳项林平胡志敏董会于书欣姜伯玮赵蕾欧元赵兴春叶健厦门市公安局福建厦门361003 中国人民公安大学北京100038 重庆市公安局巴南区分局刑警支队重庆401320 法庭科学生物芯片工程实验室北京100038 公安部第一研究所北京100048 公安部物证鉴定中心北京100038

目的探索FTA卡血样快速直接pcr扩增方法,比较相关方法的应用价值。方法将DNA TyperTM19试剂盒分别与3种快速试剂(Roche、TaKaRa、Fermentas)组合,以FTA卡血样为模板构建扩增体系,按照经优化的循环参数进行快速直接扩增,并与Typer19试剂... 详细信息

目的探索FTA卡血样快速直接pcr扩增方法,比较相关方法的应用价值。方法将DNA TyperTM19试剂盒分别与3种快速试剂(Roche、TaKaRa、Fermentas)组合,以FTA卡血样为模板构建扩增体系,按照经优化的循环参数进行快速直接扩增,并与Typer19试剂盒常规方法相比较,对方法进行评价。结果 Typer19试剂盒分别与3种快速pcr检验试剂进行组合,均可实现快速直接扩增,STR分型结果均与常规方法一致,扩增用时60min,较常规扩增所需的215min缩短了约70%,但Typer19试剂盒与Roche试剂组合基因座间峰高有部分不平衡;与TaKaRa试剂组合扩增个别基因座出现双肩锋;与Fermentas试剂组合扩增峰高明显不平衡,且个别基因座存在双肩峰。结论应用DNA TyperTM19试剂盒与快速试剂组合直接pcr扩增方法,可有效缩短扩增时间,可根据效果在相关实践中选择使用。

关键词：法医物证学 DNA TyperTM19试剂盒 STR 快速pcr 直接pcr

种传番茄溃疡病菌直接pcr和免疫捕捉pcr检测方法之比较

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植物检疫 2010年第4期24卷 12-16页

作者：闵现华韩跃武刘箐王军平刘雅莉文朝慧刘姝彤宋蕤施颖波兰州大学基础医学院医学生物化学与分子生物学研究所甘肃兰州730000 甘肃出入境检验检疫局兰州大学生命科学院细胞生物学研究所甘肃农业大学食品科学与工程学院

用PBS和种子研磨后的普通病原提取液稀释番茄溃疡病菌纯菌液,并以梯度纯菌液和带菌种子提取液作为模板进行直接pcr和免疫捕捉pcr,比较2种方法在纯菌液和带菌种子提取液中的检测灵敏度,找到一种高特异性、高灵敏度、简便快捷的方法用于... 详细信息

用PBS和种子研磨后的普通病原提取液稀释番茄溃疡病菌纯菌液,并以梯度纯菌液和带菌种子提取液作为模板进行直接pcr和免疫捕捉pcr,比较2种方法在纯菌液和带菌种子提取液中的检测灵敏度,找到一种高特异性、高灵敏度、简便快捷的方法用于检测番茄种子携带的番茄溃疡病菌。结果显示在纯菌液中直接pcr灵敏度为104cfu/mL,免疫捕捉pcr为102cfu/mL;在带菌种子提取液中直接pcr灵敏度为106cfu/mL,免疫捕捉pcr为104cfu/mL;免疫捕捉pcr比直接pcr灵敏度高100倍,尤其在实际种子检测中优势更明显,而且检出时间短,重复性好。

关键词：番茄溃疡病番茄种子直接pcr 免疫捕捉pcr

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东方泰勒虫直接pcr检测方法的建立及应用

东方泰勒虫直接PCR检测方法的建立及应用

作者：赵云延边大学

学位级别：硕士

东方泰勒虫(Theileria Oriental)是一种经蜱传播的胞内原生动物寄生虫,在世界范围内广泛分布。该病原体能够引发牛东方泰勒虫病,其主要临床表现为发热、溶血性贫血、生产力下降、乳牛和肉牛的流产或死亡,给养牛业造成了经济损失和危害... 详细信息

东方泰勒虫(Theileria Oriental)是一种经蜱传播的胞内原生动物寄生虫,在世界范围内广泛分布。该病原体能够引发牛东方泰勒虫病,其主要临床表现为发热、溶血性贫血、生产力下降、乳牛和肉牛的流产或死亡,给养牛业造成了经济损失和危害。目前,血液直接pcr检测方法因其不需要提取DNA而直接应用血液,从而节约时间减少成本故逐渐发展并应用于动物疾病流行病学研究。因此本试验直接以患东方泰勒虫病的牛血液为模板,建立了血液直接pcr检测方法。本文首先根据Genbank上发布的东方泰勒虫p33基因序列[DQ078264.1]设计一对特异性引物,并以血液为模版,采用血液直接pcr反应体系扩增出一条416 bp大小的条带,通过测序得到的核酸序列与基因文库中发表的p33基因进行序列比对同源性高达99%,进而确定该目的片段为p33基因。此外,本试验设计的引物均未能对弓形虫、新孢子虫、牛附红细胞体扩增出目的条带,说明该方法具有良好的特异性。同时,该方法能检测出1μL血液最大稀释倍数为40倍。说明该方法具有良好的敏感性。另外,分别对5份同一批的东方泰勒虫阳性血液样品进行血液直接pcr检测以及常规pcr检测并重复3次试验结果一致说明该方法重复性良好。采集吉林省多个县市共210份疑似牛东方泰勒虫抗凝血进行血液直接pcr检测,与常规pcr法进行比较,确定该方法在诊断检测方面的优势。结果显示,直接pcr总阳性率为30.0%,而常规pcr总阳性率为25.7%,两种方法的符合率为94.0%,一致性分析Kappa值为0.85。阳性符合率为80.0%,阴性符合率为92.0%;通化地区阳性率最高,为75.0%,而洮南地区阳性率最低,为12.0%,不同地区阳性率之间存在统计学差异(P<0.05)。该检测结果与胡诗悦等报道的吉林省的牛东方泰勒虫感染率为21.1%～75.9%结果相符。结果表明该方法更值得推广和应用。本试验建立一种简便、快捷、敏感、特异的东方泰勒虫快速检测方法,可适用于东方泰勒虫病的诊断和流行病调查。

关键词：东方泰勒虫 p33基因直接pcr

疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组测序分析及疥螨直接pcr检测方法的建立

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疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组测序分析及疥螨直接PCR检测方法...

作者：黄茗鑫四川农业大学

学位级别：硕士

疥螨(Sarcoptes scabiei)是寄生于动物表皮层的一种人兽共患外寄生虫,分类上属于节肢动物门、蜱螨亚纲、真螨目、疥螨科疥螨属。疥螨的宿主种类多,分布广,可严重危害动物和人类健康。疥螨早期感染多为隐型感染或亚临床感染,表现出无症... 详细信息

疥螨(Sarcoptes scabiei)是寄生于动物表皮层的一种人兽共患外寄生虫,分类上属于节肢动物门、蜱螨亚纲、真螨目、疥螨科疥螨属。疥螨的宿主种类多,分布广,可严重危害动物和人类健康。疥螨早期感染多为隐型感染或亚临床感染,表现出无症状或轻微皮肤病症状,容易被忽视或误诊。同时,在临床上疥螨病与真菌感染易混淆出现误诊。因此,建立灵敏、操作方便的检测与诊断方法对疥螨病的防控具有重要意义。本研究开展了疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组的测序与分析,同时进行了疥螨不同分子检测靶标的特异性和灵敏度筛选,在此基础上建立了疥螨直接pcr检测方法。主要研究结果如下:1、疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组的测序分析通过二代测序技术测定了疥螨犬亚种和疥螨兔亚种的线粒体基因组,研究结果显示:疥螨犬亚种线粒体基因组全长为13,930 bp,环状,G+C含量为19.29%;疥螨兔亚种线粒体基因组序列全长13,838 bp,为环状,G+C含量为19.37%。疥螨兔亚种与犬亚种线粒体基因组共有35个基因,其中20个t RNA基因,2个r RNA基因,13个蛋白质编码基因。在其蛋白质编码基因中,12个基因能注释到NR数据库,9个蛋白质基因能注释到COG功能分析数据库,仅CYTB能注释到KEGG数据库,7个基因能注释到GO数据库,10个基因能注释到SWISS库。疥螨各亚种线粒体基因的比较分析表明:ATP6、COX1、COX2、COX3、CYTB、ND1、ND4、ND4L、ND6、16S和12S基因的序列相似性很高,较为保守,可作为虫种鉴别的候选分子靶标;而ND2、ND3和ND5基因的序列差异比较大,可作为亚种鉴别的候选分子靶标。2、基于线粒体基因疥螨直接pcr诊断方法的建立为建立一种简单、快速、灵敏度高的检测疥螨感染的直接pcr方法,本研究从上一章已测序并注释的疥螨线粒体蛋白质编码基因序列中,通过靶基因及引物初筛、特异性检验、灵敏度检测挑选信息较为丰富的基因片段建立疥螨病直接pcr诊断方法的候选靶标,随后采用该靶标基因建立直接pcr方法,并验证其临床应用价值。结果如下:对7个靶标基因分别设计了3对引物,以兔疥螨基因组DNA(g DNA)作为模板进行pcr检测,共计扩增21个基因片段,其中4对引物电泳条带单一且清晰;随后采用这4对引物对绵羊痒螨兔亚种以及猪、兔、犬的宿主皮肤进行特异性检验,没有目的条带出现,表明特异性均较高。为进一步筛选灵敏度较高的引物,将疥螨g DNA稀释到5 ng/μL,随后5倍倍比稀释至0.0000064 ng/μL,得到总共10个浓度梯度作为模板进行pcr反应,发现其中基于COX1设计的第1对引物(COX1-1)在0.0000128 ng/μL时仍能检测出目的条带,灵敏度最高。采用该引物建立直接pcr方法,其特异性为100%,敏感性为96.97%,符合率为97.80%,漏诊率为4.03%,表明基于COX1-1基因片段所建立的直接pcr诊断方法特异性好,灵敏度高,与临床检测的符合率高,漏检率低,可应用于临床上疥螨病的快速诊断。

关键词：兔犬疥螨线粒体基因组测序分析直接pcr 检测

直接pcr法在口腔牙龈卟啉单胞菌检测中的应用

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食管疾病 2020年第1期2卷 38-42页

作者：谷变利王娟萍孔金玉刘雅莉张灏詹启敏高社干河南科技大学临床医学院河南科技大学第一附属医院河南科技大学肿瘤研究所河南省肿瘤表观遗传重点实验室河南洛阳471003 河南科技大学第一附属医院健康管理中心河南洛阳471003 河南省医学情报研究所河南郑州450046 暨南大学医学院肿瘤精准医学与病理研究所广东广州510632 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室北京100021

目的为了便于食管癌大规模流行病学筛查工作的开展,探讨一种能快速敏感地检测口腔牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,***)DNA的免核酸抽提直接pcr方法。方法收集我院门诊100例体检人员的200份口腔拭子(每人双份),以TE buffer(10 ... 详细信息

目的为了便于食管癌大规模流行病学筛查工作的开展,探讨一种能快速敏感地检测口腔牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,***)DNA的免核酸抽提直接pcr方法。方法收集我院门诊100例体检人员的200份口腔拭子(每人双份),以TE buffer(10 mM Tris,0.1 mM EDTA,pH 8.0)、商品化裂解液以及核酸抽提试剂盒等作为基因组提取试剂,使用***特异引物探针进行直接定量pcr检测。结果与裂解液-直接qpcr法相比,TE-直接qpcr法的灵敏度为94.12%,特异性为100%;与试剂盒-qpcr法相比,TE-直接qpcr法的灵敏度与特异性均为100%;TE-直接qpcr法与裂解液-直接qpcr法以及与试剂盒-qpcr法检测***均具有高度一致性(分别为Kappa=0.954,Kappa=1);TE-直接qpcr法与试剂盒-qpcr法检测阳性***的Ct均值无显著差异(P=0.907)。结论TE-直接qpcr法检测口腔***灵敏度高、特异性强,是快速高效检测口腔***的理想方法,可用于食管癌大规模分子流行病学研究。

关键词：食管癌牙龈卟啉单胞菌直接pcr 分子流行病学

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直接pcr法在猕猴桃溃疡病检测中的建立

河南科技 2020年第20期39卷 139-141页

作者：李智念羊炼刘露重庆三峡农业科学院重庆404001 重庆三峡职业学院重庆404199

通过优化pcr反应体系和反应程序,本文建立了使用猕猴桃枝条为样品,直接检测猕猴桃溃疡病PSA病原菌的方法。该方法跳过了病原菌培养和DNA提取步骤,大大缩短了检测时长,利用微型pcr仪系统,使针对猕猴桃溃疡病的简单、低成本、快速现场检... 详细信息

通过优化pcr反应体系和反应程序,本文建立了使用猕猴桃枝条为样品,直接检测猕猴桃溃疡病PSA病原菌的方法。该方法跳过了病原菌培养和DNA提取步骤,大大缩短了检测时长,利用微型pcr仪系统,使针对猕猴桃溃疡病的简单、低成本、快速现场检测成为可能。

关键词：猕猴桃溃疡病检测方法直接pcr

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直接pcr法检测血液中伊氏锥虫感染

寄生虫与医学昆虫学报 2006年第4期13卷 204-207页

作者：陆绍红陈睿楼涤张乐张雪娟浙江省医学科学院寄生虫病研究所杭州310013 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所杭州310021

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的pcr扩增技术,血液直接pcr法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适pcr反应条件,建立kDNA片段的pcr扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小... 详细信息

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的pcr扩增技术,血液直接pcr法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适pcr反应条件,建立kDNA片段的pcr扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接pcr检测伊氏锥虫。结果发现,pcr扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接pcr能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接pcr法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。

关键词：伊氏锥虫直接pcr 动基体DNA(kDNA) 血液