疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组测序分析及疥螨直接PCR检测方法的建立

作     者：黄茗鑫 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨光友;徐璟

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：兔 犬 疥螨 线粒体基因组 测序分析 直接PCR 检测 

摘      要：疥螨(Sarcoptes scabiei)是寄生于动物表皮层的一种人兽共患外寄生虫,分类上属于节肢动物门、蜱螨亚纲、真螨目、疥螨科疥螨属。疥螨的宿主种类多,分布广,可严重危害动物和人类健康。疥螨早期感染多为隐型感染或亚临床感染,表现出无症状或轻微皮肤病症状,容易被忽视或误诊。同时,在临床上疥螨病与真菌感染易混淆出现误诊。因此,建立灵敏、操作方便的检测与诊断方法对疥螨病的防控具有重要意义。本研究开展了疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组的测序与分析,同时进行了疥螨不同分子检测靶标的特异性和灵敏度筛选,在此基础上建立了疥螨直接PCR检测方法。主要研究结果如下:1、疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组的测序分析通过二代测序技术测定了疥螨犬亚种和疥螨兔亚种的线粒体基因组,研究结果显示:疥螨犬亚种线粒体基因组全长为13,930 bp,环状,G+C含量为19.29%;疥螨兔亚种线粒体基因组序列全长13,838 bp,为环状,G+C含量为19.37%。疥螨兔亚种与犬亚种线粒体基因组共有35个基因,其中20个t RNA基因,2个r RNA基因,13个蛋白质编码基因。在其蛋白质编码基因中,12个基因能注释到NR数据库,9个蛋白质基因能注释到COG功能分析数据库,仅CYTB能注释到KEGG数据库,7个基因能注释到GO数据库,10个基因能注释到SWISS库。疥螨各亚种线粒体基因的比较分析表明:ATP6、COX1、COX2、COX3、CYTB、ND1、ND4、ND4L、ND6、16S和12S基因的序列相似性很高,较为保守,可作为虫种鉴别的候选分子靶标;而ND2、ND3和ND5基因的序列差异比较大,可作为亚种鉴别的候选分子靶标。2、基于线粒体基因疥螨直接PCR诊断方法的建立为建立一种简单、快速、灵敏度高的检测疥螨感染的直接PCR方法,本研究从上一章已测序并注释的疥螨线粒体蛋白质编码基因序列中,通过靶基因及引物初筛、特异性检验、灵敏度检测挑选信息较为丰富的基因片段建立疥螨病直接PCR诊断方法的候选靶标,随后采用该靶标基因建立直接PCR方法,并验证其临床应用价值。结果如下:对7个靶标基因分别设计了3对引物,以兔疥螨基因组DNA(g DNA)作为模板进行PCR检测,共计扩增21个基因片段,其中4对引物电泳条带单一且清晰;随后采用这4对引物对绵羊痒螨兔亚种以及猪、兔、犬的宿主皮肤进行特异性检验,没有目的条带出现,表明特异性均较高。为进一步筛选灵敏度较高的引物,将疥螨g DNA稀释到5 ng/μL,随后5倍倍比稀释至0.0000064 ng/μL,得到总共10个浓度梯度作为模板进行PCR反应,发现其中基于COX1设计的第1对引物(COX1-1)在0.0000128 ng/μL时仍能检测出目的条带,灵敏度最高。采用该引物建立直接PCR方法,其特异性为100%,敏感性为96.97%,符合率为97.80%,漏诊率为4.03%,表明基于COX1-1基因片段所建立的直接PCR诊断方法特异性好,灵敏度高,与临床检测的符合率高,漏检率低,可应用于临床上疥螨病的快速诊断。