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疥螨eIF4E和UPP基因的克隆表达及免疫鉴定

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中国人兽共患病学报 2023年第5期39卷 433-439页

作者：张倩徐路阳郭茂川李晓萍李敏何冉四川农业大学动物医学院成都611130

目的克隆、表达疥螨(Sarcoptes scabiei,***)真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)和尿苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase,UPP),并鉴定其免疫原性。方法首先提取兔疥螨总RNA,通过反转录聚合酶链式反应得到cDNA,根据NCBI数据库eIF4E和UPP序列设计引物,PCR扩增获得疥螨eIF4E、UPP完整基因序列,对基因序列进行生物信息学分析,构建pET-32a(+)重组质粒,SDS-PAGE验证重组蛋白表达情况,最后免疫印迹法鉴定其免疫原性。结果疥螨eIF4E基因的开放阅读框(ORF)长度约为561 bp,编码186个氨基酸,疥螨UPP基因的ORF长度约为939 bp,编码312个氨基酸。与其他物种氨基酸序列比对显示,eIF4E、UPP氨基酸序列与粉尘螨、屋尘螨、热带无爪螨亲缘关系较近,进化树分析eIF4E、UPP氨基酸序列与节肢类动物在同一分支。同时,成功诱导表达了疥螨重组eIF4E和UPP蛋白,免疫印迹结果表明重组eIF4E和UPP蛋白可与自然感染疥螨的兔血清结合,具有较好的免疫原性。结论疥螨重组eIF4E和UPP蛋白均具有较好的免疫原性。

关键词：疥螨真核翻译起始因子尿苷磷酸化酶克隆表达免疫原性

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疥螨分类学的研究进展及展望

黑龙江畜牧兽医 2005年第4期 65-66页

作者：杨雷华育平东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040

疥螨通过接触可传播给各个年龄段的人群和动物,引起皮肤性疾病,这种疾病在世界范围内广泛流行.人疥螨病的感染率很高,世界上每年大约有3亿人感染疥螨.动物疥螨病的感染率和死亡率也都很高,据调查,我国70%～90%的猪有疥螨感染.疥螨病严... 详细信息

疥螨通过接触可传播给各个年龄段的人群和动物,引起皮肤性疾病,这种疾病在世界范围内广泛流行.人疥螨病的感染率很高,世界上每年大约有3亿人感染疥螨.动物疥螨病的感染率和死亡率也都很高,据调查,我国70%～90%的猪有疥螨感染.疥螨病严重影响人类的健康和畜牧业的发展以及野生动物的生存与种群数量的增加,给社会经济和生态环境带来巨大的危害.

关键词：疥螨分类学宿主特异性形态学分子生物学

疥螨丝切蛋白基因的原核表达、蛋白定位以及间接ELISA诊断方法的初步建立

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疥螨丝切蛋白基因的原核表达、蛋白定位以及间接ELISA诊断方法的...

作者：郑宇四川农业大学

学位级别：硕士

疥螨病作为一种重要的人兽共患寄生虫病,严重影响人类健康和生活质量,特别是在人口密度较大的区域内流行广泛,另外还能危害多种动物,给社会经济带来不可小觑的损失。目前该病已引起了世界许多国家和组织机构的重视,针对疥螨的分子学研... 详细信息

疥螨病作为一种重要的人兽共患寄生虫病,严重影响人类健康和生活质量,特别是在人口密度较大的区域内流行广泛,另外还能危害多种动物,给社会经济带来不可小觑的损失。目前该病已引起了世界许多国家和组织机构的重视,针对疥螨的分子学研究不断深入,但还没有有效的免疫学诊断方法和疫苗问世。本研究根据NCBI数据库中疥螨丝切蛋白基因的EST序列设计引物,通过扩增、克隆后获得447bp大小的目的基因片段,将测序结果在GenBamk数据库中比对后发现与已报道的尘螨主要变应原之一的Derf31基因(GenBank:KM010014.1)的序列相似性最高(90%)。根据软件预测该丝切蛋白分子量约为16.8kDa,等电点为pI=5.59,推导化学式为C751H1175N1910231S8,蛋白带负电荷,无信号肽切割位点,不存在跨膜结构域,是一种膜外蛋白。将目的基因片段连入表达载体pET32a(+)后转入表达菌大肠杆菌***21(DE3),并优化诱导条件,通过聚丙烯凝胶电泳验证该蛋白表达后,利用Ni-亲和层析柱纯化疥螨丝切蛋白。在免疫印迹实验中,疥螨丝切蛋白重组蛋白与兔疥螨阳性血清反应后产生免疫印迹条带,说明其具有良好的抗原性。利用纯化后的疥螨丝切重组蛋白免疫制备疫苗免疫实验兔,将采集到的高免血清作为一抗用于荧光组织化学实验,结果发现该蛋白广泛分布于疥螨虫体组织中,但表皮中未检测到该蛋白存在。将纯化后的丝切重组蛋白作抗原,经过条件优化筛选和特异性、重复性试验,成功建立了间接ELISA检测方法。实验结果确定抗原最佳包被浓度为5μg/mL,血清的最佳工作浓度为1:100,酶标二抗最适使用浓度为1:3000。利用cut-off计算公式确定阴阳性临界值,最后得到cut-off值为0.188,即当血清OD450≥ 0.188判为阳性,反之为阴性。再根据公式计算出特异性87.9%,敏感性83.33%。另外该方法检测出,该重组蛋白与患痒螨的和患豆状囊尾蚴的兔阳性血清均不发生交叉反应;批内变异系数在1.28%～4.08%之间,批间变异系数为1.81%～5.30%之间。本试验证明疥螨丝切重组蛋白具有潜在的诊断价值。

关键词：疥螨丝切蛋白蛋白定位 ELISA

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疥螨的免疫学与分子生物学研究进展

中国兽医杂志 2007年第8期43卷 62-64页

作者：古小彬杨光友郝桂英四川农业大学动物科技学院四川雅安625014 西昌学院动物科学系四川西昌615013

寄生于人和其他哺乳动物皮肤表皮内的疥螨(Sarcoptes scabiei Degeer,1778)隶属于真螨目(Acariformes)、疥螨科(Sarcoptidae)、疥螨属(Sarcoptes),常引起称为疥疮(又称疥癣、癞病)的一种顽固性、接触性、传染性皮肤病.

关键词：分子生物学疥螨免疫学传染性皮肤病皮肤表皮哺乳动物真螨目顽固性

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疥螨与疥螨病研究进展

中国兽医杂志 2004年第11期40卷 36-39页

作者：曾智勇杨光友梁海英四川农业大学动物生物技术中心四川雅安625014 四川农业大学动物科技学院四川雅安625014 成都华西希望农业科学技术研究所四川成都611430

疥螨病通常是指由疥螨科、疥螨属的疥螨(Sarcoptes scabiei)寄生于人和其他哺乳动物皮肤表皮内,引起称为疥疮(又称疥癣、癞病)的一种顽固、接触性、传染性皮肤病,其以剧痒、结痂、脱毛和皮肤增厚为特征.1698年意大利的两位学者首次对疥... 详细信息

疥螨病通常是指由疥螨科、疥螨属的疥螨(Sarcoptes scabiei)寄生于人和其他哺乳动物皮肤表皮内,引起称为疥疮(又称疥癣、癞病)的一种顽固、接触性、传染性皮肤病,其以剧痒、结痂、脱毛和皮肤增厚为特征.1698年意大利的两位学者首次对疥螨病进行了说明和描述;然而,直到200年后疥螨病才逐渐被人们所认识,并认为该病是由一种寄生性生物(疥螨)所引起的具有传染性的疾病[1].经过一个多世纪的研究,各国已在这方面积累了大量的研究资料,综述如下.

关键词：疥螨疥螨病疥螨科寄生疥疮传染性皮肤病

疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组测序分析及疥螨直接PCR检测方法的建立

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疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组测序分析及疥螨直接PCR检测方法...

作者：黄茗鑫四川农业大学

学位级别：硕士

疥螨(Sarcoptes scabiei)是寄生于动物表皮层的一种人兽共患外寄生虫,分类上属于节肢动物门、蜱螨亚纲、真螨目、疥螨科疥螨属。疥螨的宿主种类多,分布广,可严重危害动物和人类健康。疥螨早期感染多为隐型感染或亚临床感染,表现出无症... 详细信息

疥螨(Sarcoptes scabiei)是寄生于动物表皮层的一种人兽共患外寄生虫,分类上属于节肢动物门、蜱螨亚纲、真螨目、疥螨科疥螨属。疥螨的宿主种类多,分布广,可严重危害动物和人类健康。疥螨早期感染多为隐型感染或亚临床感染,表现出无症状或轻微皮肤病症状,容易被忽视或误诊。同时,在临床上疥螨病与真菌感染易混淆出现误诊。因此,建立灵敏、操作方便的检测与诊断方法对疥螨病的防控具有重要意义。本研究开展了疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组的测序与分析,同时进行了疥螨不同分子检测靶标的特异性和灵敏度筛选,在此基础上建立了疥螨直接PCR检测方法。主要研究结果如下:1、疥螨犬亚种和兔亚种线粒体基因组的测序分析通过二代测序技术测定了疥螨犬亚种和疥螨兔亚种的线粒体基因组,研究结果显示:疥螨犬亚种线粒体基因组全长为13,930 bp,环状,G+C含量为19.29%;疥螨兔亚种线粒体基因组序列全长13,838 bp,为环状,G+C含量为19.37%。疥螨兔亚种与犬亚种线粒体基因组共有35个基因,其中20个t RNA基因,2个r RNA基因,13个蛋白质编码基因。在其蛋白质编码基因中,12个基因能注释到NR数据库,9个蛋白质基因能注释到COG功能分析数据库,仅CYTB能注释到KEGG数据库,7个基因能注释到GO数据库,10个基因能注释到SWISS库。疥螨各亚种线粒体基因的比较分析表明:ATP6、COX1、COX2、COX3、CYTB、ND1、ND4、ND4L、ND6、16S和12S基因的序列相似性很高,较为保守,可作为虫种鉴别的候选分子靶标;而ND2、ND3和ND5基因的序列差异比较大,可作为亚种鉴别的候选分子靶标。2、基于线粒体基因疥螨直接PCR诊断方法的建立为建立一种简单、快速、灵敏度高的检测疥螨感染的直接PCR方法,本研究从上一章已测序并注释的疥螨线粒体蛋白质编码基因序列中,通过靶基因及引物初筛、特异性检验、灵敏度检测挑选信息较为丰富的基因片段建立疥螨病直接PCR诊断方法的候选靶标,随后采用该靶标基因建立直接PCR方法,并验证其临床应用价值。结果如下:对7个靶标基因分别设计了3对引物,以兔疥螨基因组DNA(g DNA)作为模板进行PCR检测,共计扩增21个基因片段,其中4对引物电泳条带单一且清晰;随后采用这4对引物对绵羊痒螨兔亚种以及猪、兔、犬的宿主皮肤进行特异性检验,没有目的条带出现,表明特异性均较高。为进一步筛选灵敏度较高的引物,将疥螨g DNA稀释到5 ng/μL,随后5倍倍比稀释至0.0000064 ng/μL,得到总共10个浓度梯度作为模板进行PCR反应,发现其中基于COX1设计的第1对引物(COX1-1)在0.0000128 ng/μL时仍能检测出目的条带,灵敏度最高。采用该引物建立直接PCR方法,其特异性为100%,敏感性为96.97%,符合率为97.80%,漏诊率为4.03%,表明基于COX1-1基因片段所建立的直接PCR诊断方法特异性好,灵敏度高,与临床检测的符合率高,漏检率低,可应用于临床上疥螨病的快速诊断。

关键词：兔犬疥螨线粒体基因组测序分析直接PCR 检测

疥螨原肌球蛋白基因的克隆、表达与蛋白定位研究

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疥螨原肌球蛋白基因的克隆、表达与蛋白定位研究

作者：吉色曲伍四川农业大学

学位级别：硕士

疥螨病是一种常见的人兽共患寄生虫病,具有高度传染性,能导致人和动物剧痒及各种类型的皮炎,是一种顽固性、接触性、传染性皮肤病。长期药物治疗疥螨病存在药物残留、环境污染等问题。目前尚无可用于免疫防治的疥螨疫苗。尽管寄生虫疫... 详细信息

疥螨病是一种常见的人兽共患寄生虫病,具有高度传染性,能导致人和动物剧痒及各种类型的皮炎,是一种顽固性、接触性、传染性皮肤病。长期药物治疗疥螨病存在药物残留、环境污染等问题。目前尚无可用于免疫防治的疥螨疫苗。尽管寄生虫疫苗的研制较为困难,但相信随着分子生物学的不断发展,疥螨基因文库的不断完善,疥螨基因工程疫苗将会成为防治疥螨病最有前景的方法之一本研究参考GenBank中收录的粉尘螨（D17682）、屋尘螨（AF016278）和痒螨（AM114276）原肌球蛋白（Tropomyosin）基因序列设计引物,对提取的疥螨总RNA进行RT-PCR扩增与克隆,测序结果得到了855bp的目的基因片段。通过对该基因核苷酸序列进行分析,与已报道的粉尘螨、屋尘螨和痒螨原肌球蛋白（Tm）基因的序列同源性分别为87.60%,85.26%和85.03%。预测其表达的重组蛋白大小约为50.90kDa,理论等电点值为pI=4.43,具有很强的亲水性。推导的化学式为C[39] H2318N412O4878S10,带负电荷。该蛋白不存在信号肽切割位点,也不存在跨膜结构域,是一种膜外蛋白。将目的片段插入pET32a（+）表达载体上,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用浓度为1.0mM/L的IPTG诱导表达了疥螨原肌球蛋白,通过SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约50kDa处有明显的表达条带。进一步优化诱导表达条件,结果表明该重组蛋白在37℃温度下,IPTG浓度为0.4mol/L,诱导4h时基本达到最大表达量。用兔疥螨阳性血清作为一抗进行免疫印迹反应,发现重组表达蛋白可与兔疥螨阳性血清反应,产生蛋白免疫印迹带,说明表达的重组蛋白具有抗原性。将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备乳剂苗,用其免疫家兔,获得高免血清,并通过免疫组织化学SP技术,对疥螨原肌球蛋白进行组织定位,试验结果表明该蛋白主要在疥螨口器和四肢的肌肉,躯体表皮以及内脏器官表膜中表达。

关键词：疥螨原肌球蛋白克隆原核表达蛋白定位

疥螨硫氧还蛋白过氧化物酶的应用研究及肌钙蛋白C基因的克隆与序列分析

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疥螨硫氧还蛋白过氧化物酶的应用研究及肌钙蛋白C基因的克隆与序...

作者：张润慧四川农业大学

学位级别：硕士

疥螨病通常是指隶属于真螨目(Acariformes)、疥螨科(Sarcoptidae)、疥螨属(Sarcoptes)的疥螨寄生于人和其他哺乳动物表皮内而引起一种顽固性、接触性、传染性的皮肤病,主要以剧痒、结痂、脱毛和皮肤增厚为特征。疥螨病被认为是一种很重... 详细信息

疥螨病通常是指隶属于真螨目(Acariformes)、疥螨科(Sarcoptidae)、疥螨属(Sarcoptes)的疥螨寄生于人和其他哺乳动物表皮内而引起一种顽固性、接触性、传染性的皮肤病,主要以剧痒、结痂、脱毛和皮肤增厚为特征。疥螨病被认为是一种很重要的公共卫生疾病,特别是在生活水平落后的地区,严重威胁着人类和动物的健康。本论文在前人研究工作的基础上,开展了疥螨硫氧还蛋白过氧化物酶基因和肌钙蛋白C基因的研究,取得的创新性成果如下：一、疥螨硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆表达、免疫组化及重组抗原Dot-ELISA检测方法的建立本研究主要鉴定了疥螨硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)的基本特征以及评估重组蛋白实验室诊断兔疥螨病的诊断效果。主要通过克隆、表达并使通过免疫组织化学方法鉴定该蛋白分布情况,通过Dot-ELISA实验对203个血清样本进行检测。结果显示该基因ORF框为489bp,编码162个氨基酸,推导的蛋白分子大小为18.11kDa,与痒螨TPx基因同源性高达98.77%;通过氨基酸序列得知该蛋白属于2-半胱氨酸家族的过氧化物;免疫组织化学结果显示疥螨TPx主要分布于螨虫的前段肌肉组织以及表皮部分;Dot-ELISA结果显示该重组蛋白表现出十分优良的诊断性能,有95%的敏感性和93.8%的特异性,与痒螨病的兔血清存在有交叉反应。本研究鉴定了疥螨TPx基因的基本特征以及采用快速、便捷的Dot-ELISA诊断方法鉴定该重组蛋白是诊断疥螨病有效的诊断抗原,可以为临床诊断疥螨病提供试验依据。二、疥螨肌钙蛋白C基因的克隆及序列分析本试验为克隆疥螨肌钙蛋白C(SsTnC)基因并进行序列分析,本研究对疥螨总RNA进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序的到目的片段,再用目的片段基因序列与GenBank库其他物种的序列进行BLAST比对,并且对推导的蛋白结构进行分析。结果表明,疥螨肌钙蛋白C基因完整的ORF框为462bp,编码153个氨基酸,推导的蛋白分子量大小约为17.62kDa,pI=4.15。SsTnC基因与痒螨和仓储螨肌钙蛋白C基因同源性高达90%以上,其蛋白同源性也分别为98.7%和95%。蛋白结构分析发现该蛋白具有4个EF手图像结合位点,同源性分析发现该蛋白可能具有交叉变应原性,属于钙依赖性变应原。本研究对于疥螨病防治的研究以及肌钙蛋白C的蛋白功能的研究具有借鉴意义。

关键词：疥螨硫氧还蛋白过氧化物酶肌钙蛋白C 免疫组化 Dot-ESLIA 序列分析

印楝油不同溶剂提取物对兔疥螨幼虫的离体效力试验

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畜牧与兽医 2008年第6期40卷 88-90页

作者：杜永华贾仁勇殷中琼蒲中慧唐婕朱碧从高峰四川农业大学动物医学院四川雅安625014

采用浸杀方式分别比较了印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯溶剂提取物的杀螨活性,并测定了活性和得率高的溶剂提取物对兔疥螨幼虫的离体毒力,应用互补重对数模型对毒力测定数据进行分析。结果表明:印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯溶剂提取物... 详细信息

采用浸杀方式分别比较了印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯溶剂提取物的杀螨活性,并测定了活性和得率高的溶剂提取物对兔疥螨幼虫的离体毒力,应用互补重对数模型对毒力测定数据进行分析。结果表明:印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯溶剂提取物的得率分别为56.82%、25.36%和5.14%。印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯溶剂提取物都具有一定杀螨活性,其中石油醚提取物活性最高,氯仿和乙酸乙酯提取物活性相近。石油醚提取物和氯仿提取物对幼螨的毒力表现为:24 h半数致死浓度(median lethal concentration,LC50)分别为1.347 7,3.917 4μL/mL,500μL/mL的半数致死时间(median lethal time,LT50)为8.404 0 h和9.643 4 h。

关键词：印楝油疥螨效力互补重对数模型兔