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中华临床感染病杂志 2022年第6期15卷 468-471页

作者：李梦曌孙文强朱雪萍苏州大学附属儿童医院新生儿科 215025

百日咳杆菌是一种生长缓慢的革兰阴性小球杆菌,多局限于呼吸道感染,血源性感染极为罕见,仅见于有免疫缺陷或免疫抑制剂使用史的成人,婴儿中未见报道。本文报道1例百日咳菌血症婴儿,经治疗后取得了良好疗效。

关键词：百日咳杆菌菌血症婴儿宏基因组二代测序

百日咳杆菌脂多糖分子关键基团2-乙酰氨基-4-氨甲基岩藻糖生物合成途径解析

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百日咳杆菌脂多糖分子关键基团2-乙酰氨基-4-氨甲基岩藻糖生物合...

作者：王梁嘉江南大学

学位级别：硕士

百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella pertussis)是一种广泛存在的,引起呼吸道感染的革兰氏阴性杆菌。脂多糖(LPS)作为胞壁结构上的重要毒力因子,可以作为百日咳疫苗的有效抗原成分。B.pertussis的脂多糖结构由类脂A、核心低聚糖和末端三糖组成... 详细信息

百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella pertussis)是一种广泛存在的,引起呼吸道感染的革兰氏阴性杆菌。脂多糖(LPS)作为胞壁结构上的重要毒力因子,可以作为百日咳疫苗的有效抗原成分。B.pertussis的脂多糖结构由类脂A、核心低聚糖和末端三糖组成,其中末端三糖的存在与否与疫苗的抗原活性悉悉相关。但百日咳中鲍特氏杆菌末端三糖的FucNAc4NMe的生物合成基因和合成途径目前还不明确,值得进一步研究。本课题研究了B.pertussis CS的脂多糖结构中与FucNAc4NMe的生物合成相关基因,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、液相色谱质谱联用(LC-MS)、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)和核磁共振波谱分析(NMR)等方法鉴定了 FucNAc4NMe在大肠杆菌中的合成。以此推测了一条假定的FucNAc4NMe在百日咳杆菌中的生物合成转移途径。主要研究结果如下:(1)通过生物信息学分析手段(蛋白同源比对和酶蛋白保守结构域)分析B.pertussis CS菌株末端三糖生物合成位点bpl基因簇。结果表明,bpl位点中有四个基因可能与FucNAc4NMe合成转运有关,BplF与枯草芽孢杆菌的4-氨基转移酶SpsC有较高同源性,BplL与铜绿假单胞菌的脱水酶WbpM和空肠弯曲杆菌的异构酶PglF有较高的同源性,BplG被鉴定为具有糖基转移酶功能,bplI编码酶蛋白可以弥补大肠杆菌(E.coli)中murJ基因的缺失。(2)选择合适的宿主大肠杆菌对FucNAc4NMe的生物合成进行研究。构建包含基因bplF、bplG、bplL和bplI的质粒在MDCO001/pW菌株中表达。外源表达这四个基因可以产生具有新结构的脂多糖,即外源表达的产物可以连接到基因改造的大肠杆菌核心糖-类脂A上。外源基因的表达对菌株生长没有不利影响。表达菌株单糖组成分析表示重组菌在保留时间2.5 min有新的产物峰,且肠共同抗原(ECA)和克拉酸(CA)的存在可能会对分析过程造成干扰。因此选择MDCO001/pW菌株基础上删除共同抗原和克拉酸合成相关基因的菌株MDCO020/pW作为异源表达百日咳杆菌CS菌株FucNAc4NMe合成相关基因的宿主菌。(3)确定构建一系列由负责FucNAc4NMe转移的转移酶BplG与其他合成相关的基因不同组合的表达质粒得到多个合成FucNAc4NMe或其中间体的表达菌株。对重组菌进行了生理特性的分析,鉴定了脂多糖结构改变对细菌的影响。对脂多糖完整结构鉴定发现,BplL在FucNAc4NMe合成过程中具有重要作用,转移酶BplG不仅识别FucNAc4NMe,还可以识别合成过程的中间体进行转移。对MDCO020/pWpBR核心寡糖进行精细结构分析,确认单糖组成分析时的干扰来自于ECA和CA重复单元。并且证明了保留时间为2.5 min显示的峰代表外源表达产物。经NMR分析,鉴定了FucNAc4NMe在大肠杆菌中的合成,并总结一条FucNAc4NMe的生物合成转运途径。

关键词：百日咳杆菌脂多糖 2-乙酰氨基-4-氨甲基-岩藻糖末端三糖大肠杆菌

百日咳杆菌效应CpG-ODNs调控变应性哮喘Toll信号分子的实验研究

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药学学报 2011年第3期46卷 285-292页

作者：张宝袁迟深孙云扬州大学医学院药理学教研室江苏扬州225001

从百日咳杆菌中分离出非甲基化寡核苷酸单链(CpG-ODNs),建立卵白蛋白(OVA)致敏的小鼠急性哮喘与慢性哮喘模型,经急性哮喘模型从百日咳杆菌CpG-ODNs与9条相似度高且含有CG片段的seq A～seq I序列中筛选出有效序列(seq A),以seq A腹腔注射... 详细信息

从百日咳杆菌中分离出非甲基化寡核苷酸单链(CpG-ODNs),建立卵白蛋白(OVA)致敏的小鼠急性哮喘与慢性哮喘模型,经急性哮喘模型从百日咳杆菌CpG-ODNs与9条相似度高且含有CG片段的seq A～seq I序列中筛选出有效序列(seq A),以seq A腹腔注射(ip)及灌胃(ig)对急、慢性哮喘小鼠分别进行干预。检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞(WBC)总数和嗜酸性粒细胞(EOS)数,酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF中细胞因子及血管内皮生长因子(VEGF)水平。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测小鼠脾细胞TLR-9 mRNA表达量;蛋白印迹(Western blotting)法检测小鼠肺组织TLR-9蛋白表达。结果表明,小鼠急性哮喘模型经腹腔注射及灌胃seq A预处理,可明显抑制BALF中WBC总数增加,显著抑制EOS增加;百日咳杆菌、CpG+及seq A～seq D灌胃组亦显著抑制EOS增加,而seq E～seq I作用不明显;上述各序列干预组以腹腔注射途径抑制EOS作用较为显著。对小鼠慢性哮喘模型,CpG+和seq A腹腔注射预处理均能明显上调BALF中γ干扰素(IFN-γ)①空白对照组:(176.45±23.46)pg.mL-1;②模型组:(174.11±22.71)pg.mL-1;③CpG+(ip):(220.56±15.42)pg.mL-1;④seq A(ip):(225.23±21.60)pg.mL-1;并下调白介素-4(IL-4)①空白对照组:(66.91±5.81)pg.mL-1;②模型组:(81.02±11.24)pg.mL-1;③CpG+(ip):(63.99±6.09)pg.mL-1;④seq A(ip):(62.75±10.03)pg.mL-1;各序列组对VEGF无显著影响(P>0.05);seq A腹腔注射亦能上调小鼠脾细胞TLR-9 mRNA(TLR-9/GAPDH)①空白对照组:0.62±0.13;②模型组:0.66±0.17;③CpG+(ip):1.46±0.26;④seq A(ip):1.42±0.34及肺组织TLR-9蛋白表达(TLR-9/β-actin)①空白对照组:0.63±0.16;②模型组:0.61±0.07;③CpG+(ip):1.15±0.25;④seq A(ip):1.03±0.29;但经灌胃途径无明显影响。结果显示,CpG-ODNs和获得的CpG序列seq A可显著抑制哮喘模型的气道炎症反应以及相应炎症细胞因子水平的改变,其作用机制可能与调节Th1/Th2平衡、调控Toll样受体9(TLR-9)表达有关。

关键词：哮喘百日咳杆菌寡核苷酸单链 Th1/Th2 TLR-9

百日咳杆菌无动物源培养基的筛选及其对百日咳毒素和丝状血凝素产量的影响

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中国生物制品学杂志 2018年第2期31卷 129-133页

作者：陈元芬马礼耕吴强王文王宇张建军成都欧林生物科技股份有限公司四川成都611731

目的确定百日咳杆菌无动物源培养基最佳配方,并检测其对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)产量的影响。方法分别按一定比例混合使用或单独使用无动物源蛋白Hy Pep5603(小米和小麦蛋白)、精... 详细信息

目的确定百日咳杆菌无动物源培养基最佳配方,并检测其对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)产量的影响。方法分别按一定比例混合使用或单独使用无动物源蛋白Hy Pep5603(小米和小麦蛋白)、精选大豆胨,替代培养基中动物源性成分(酸水解酪蛋白)作为氮源,进行百日咳杆菌摇瓶培养,比较细菌生长密度和产物生产量。以最高PT和FHA产量为参考标准,确定最佳培养基配方。用该配方与动物源培养基对比,进行4批30 L百日咳杆菌发酵培养;发酵液处理后,用离子交换层析分离PT和FHA样品,ELISA法测定各样品中PT和FHA的蛋白含量,SDS-PAGE法检测产物的相对分子质量大小。结果由无动物氮源Hy Pep56034.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L加改良SS培养基组成的培养基,摇瓶培养百日咳杆菌后最高A550为3.8,发酵百日咳杆菌后最高A550为5.8,均能有效地供菌体生长,且优于单独使用动物源或无动物源培养基;用该配方发酵百日咳杆菌并纯化,获得PT的产量约为5.7 mg/L,FHA产量约为23.0 mg/L,均高于用动物源培养基培养后的产物,且相对分子质量大小一致。结论用含Hy Pep5603 4.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L的无动物源培养基培养百日咳杆菌,可替代动物源培养基,用于PT和FHA的生产。

关键词：百日咳杆菌无动物源培养基百日咳毒素丝状血凝素

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百日咳杆菌耐药

中华实用儿科临床杂志 2016年第4期31卷 263-265页

作者：杨永弘杨颖首都医科大学附属北京儿童医院北京市儿科研究所微生物研究室儿科学国家重点学科教育部儿科重大疾病研究重点实验室国家呼吸系统疾病临床医学研究中心100045

大环内酯类抗生素是治疗百日咳的首选药物。然而，近年来出现了百日咳杆菌对红霉素等大环内酯类抗生素耐药的现象，局部监测耐药率甚至达到90％。现将从百日咳杆菌耐药情况、耐药机制、耐药后的抗生素选择、耐药的防治和控制等方面进行... 详细信息

大环内酯类抗生素是治疗百日咳的首选药物。然而，近年来出现了百日咳杆菌对红霉素等大环内酯类抗生素耐药的现象，局部监测耐药率甚至达到90％。现将从百日咳杆菌耐药情况、耐药机制、耐药后的抗生素选择、耐药的防治和控制等方面进行综述。

关键词：百日咳杆菌红霉素耐药

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百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品的研制

中国生物制品学杂志 2021年第12期34卷 1449-1455,1462页

作者：夏德菊周海卫王薇许四宏中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室北京100050

目的研制百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对21份病原体培养物的复核、确证,关键抗原位点等位基因分析、红霉素耐药位点测序分析,组成百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品,经多家实验室协助标定,确定参考品的... 详细信息

目的研制百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对21份病原体培养物的复核、确证,关键抗原位点等位基因分析、红霉素耐药位点测序分析,组成百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品,经多家实验室协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品由12份阴性、10份阳性、1份检出限和1份精密度样品组成。质量标准为12份阴性参考品应均检出阴性;10份阳性参考品应均检出阳性,若为百日咳杆菌红霉素耐药位点检测试剂盒,P1、P3、P6、P7和P9需检出耐药位点阳性;精密度参考品重复检测10次,要求均为百日咳杆菌阳性,且其检测值的变异系数(CV)应不大于5.0%,若为百日咳杆菌红霉素耐药位点检测试剂盒,重复检测10次,要求均为耐药位点阳性,且其检测值的CV不大于5.0%;最低检出限参考品要求对于选择IS481靶区的试剂,浓度为100cfu/mL及以上时,检测结果应为百日咳杆菌阳性;其他靶区试剂要求浓度为1×10^(4)cfu/mL及以上时,检测结果应为百日咳杆菌阳性,若为百日咳杆菌红霉素耐药位点检测试剂盒,要求浓度为1×10^(4)cfu/mL及以上时,需检出耐药位点阳性。参考品的均匀性及稳定性均符合要求。结论研制的百日咳杆菌核酸检测试剂国家参考品可用于百日咳杆菌核酸检测试剂的质量控制及评价。

关键词：百日咳杆菌核酸检测试剂红霉素耐药国家参考品

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百日咳杆菌的分子流行病学研究

临床儿科杂志 2010年第9期28卷 836-839页

作者：欧金玲姚开虎袁林俞桑洁沈叙庄杨永弘北京市石景山医院儿科北京100043 首都医科大学附属北京儿童医院北京市儿科研究所北京100045

目的明确百日咳杆菌分离株的分子分型,比较不同年代分离株的型别差异。方法共25株百日咳菌株,其中18株为2000年至2007年北京儿童医院临床分离株,7株为20世纪70年代分离株,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)2种方法对菌株... 详细信息

目的明确百日咳杆菌分离株的分子分型,比较不同年代分离株的型别差异。方法共25株百日咳菌株,其中18株为2000年至2007年北京儿童医院临床分离株,7株为20世纪70年代分离株,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)2种方法对菌株进行分型。结果 2000年以后菌株MLST分型均为ST2型,PFGE分型分为8种型;20世纪70年代菌株MLST分型均为ST1型,PFGE分为5种型。2000年后菌株与20世纪70年代菌株无相同的PFGE型和MLST型。结论不同时期流行的百日咳杆菌具有不同的分子分型。

关键词：百日咳杆菌脉冲场凝胶电泳多位点序列分型分子流行病学

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百日咳杆菌外膜蛋白的制备和特性鉴定

中华微生物学和免疫学杂志 1989年第1期9卷 48-52页

作者：疏正胜李忠明卫生部上海生物制品研究所

本文就百日咳杆菌外膜蛋白（OMP）的制备和部分特性进行了初步研究；经超声波破碎菌体、超离心富集外壳蛋白成份、再使用Triton X-100除去内膜成份获得OMP。实验表明，TritonX-100一次性抽提OMP得率为5.7%。电镜下OMP为典型的单层膜球... 详细信息

本文就百日咳杆菌外膜蛋白（OMP）的制备和部分特性进行了初步研究；经超声波破碎菌体、超离心富集外壳蛋白成份、再使用Triton X-100除去内膜成份获得OMP。实验表明，TritonX-100一次性抽提OMP得率为5.7%。电镜下OMP为典型的单层膜球形颗粒，且在SDS-PAGE图谱中存在其Ⅰ相菌株OMP所特有的30K和28K两个蛋白带。样品中脂多糖的相对含量仅为其蛋白含量的1/3000。OMP与其相应抗血清及抗全菌体血清均产生清晰的免疫双扩沉淀线。OMP的小鼠毒性安全剂量为20.8µg/ml，小鼠半数保护剂量为2.7µg/ml，两者差值达7.7倍。所制备的抗OMP血清在小鼠也具有被动保护作用，保护率约为60～70%。可见：制备的OMP具有低毒和较好的保护活性，且制备简便经济。其在百日咳无细胞菌苗研制中可能具有潜在的应用价值。

关键词：百日咳杆菌外膜蛋白制备

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

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中国生物制品学杂志 2010年第1期23卷 9-12页

作者：石碧珠张华捷孟民杰张庶民广东药学院生命科学与生物制药学院广州510006 中国药品生物制品检定所血清室北京100050

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达... 详细信息

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。

关键词：百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因克隆表达

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素的功能性应用研究进展

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广东医学 2010年第2期31卷 247-249页

作者：石碧珠孟民杰张华捷中国药品生物制品检定所血清室北京100050 广东药学院生命科学与生物制药学院广州510006

百日咳杆菌分泌的腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin, CyaA)是百日咳杆菌的重要致病因子之一,同时也是诱发机体产生抗百日咳免疫的潜在保护性抗原之一.近年来的研究表明,CyaA不仅具有腺苷酸环化酶活性和溶血素活性,还在疫苗佐... 详细信息

百日咳杆菌分泌的腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin, CyaA)是百日咳杆菌的重要致病因子之一,同时也是诱发机体产生抗百日咳免疫的潜在保护性抗原之一.近年来的研究表明,CyaA不仅具有腺苷酸环化酶活性和溶血素活性,还在疫苗佐剂、抗原呈递、蛋白疫苗载体、肿瘤治疗和免疫调节等方面,有深入的研究价值.本文主要对百日咳杆菌CyaA的应用研究现状作一综述,旨在对CyaA的研究价值进行探讨.

关键词：腺苷酸环化酶百日咳杆菌毒素功能性免疫调节保护性抗原溶血素活性致病因子