百日咳杆菌脂多糖分子关键基团2-乙酰氨基-4-氨甲基岩藻糖生物合成途径解析

作     者：王梁嘉 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王小元;刘佳

授予年度：2022年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 10[医学] 

主      题：百日咳杆菌 脂多糖 2-乙酰氨基-4-氨甲基-岩藻糖 末端三糖 大肠杆菌 

摘      要：百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella pertussis)是一种广泛存在的,引起呼吸道感染的革兰氏阴性杆菌。脂多糖(LPS)作为胞壁结构上的重要毒力因子,可以作为百日咳疫苗的有效抗原成分。***的脂多糖结构由类脂A、核心低聚糖和末端三糖组成,其中末端三糖的存在与否与疫苗的抗原活性悉悉相关。但百日咳中鲍特氏杆菌末端三糖的FucNAc4NMe的生物合成基因和合成途径目前还不明确,值得进一步研究。本课题研究了*** CS的脂多糖结构中与FucNAc4NMe的生物合成相关基因,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、液相色谱质谱联用(LC-MS)、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)和核磁共振波谱分析(NMR)等方法鉴定了 FucNAc4NMe在大肠杆菌中的合成。以此推测了一条假定的FucNAc4NMe在百日咳杆菌中的生物合成转移途径。主要研究结果如下:(1)通过生物信息学分析手段(蛋白同源比对和酶蛋白保守结构域)分析*** CS菌株末端三糖生物合成位点bpl基因簇。结果表明,bpl位点中有四个基因可能与FucNAc4NMe合成转运有关,BplF与枯草芽孢杆菌的4-氨基转移酶SpsC有较高同源性,BplL与铜绿假单胞菌的脱水酶WbpM和空肠弯曲杆菌的异构酶PglF有较高的同源性,BplG被鉴定为具有糖基转移酶功能,bplI编码酶蛋白可以弥补大肠杆菌(***)中murJ基因的缺失。(2)选择合适的宿主大肠杆菌对FucNAc4NMe的生物合成进行研究。构建包含基因bplF、bplG、bplL和bplI的质粒在MDCO001/pW菌株中表达。外源表达这四个基因可以产生具有新结构的脂多糖,即外源表达的产物可以连接到基因改造的大肠杆菌核心糖-类脂A上。外源基因的表达对菌株生长没有不利影响。表达菌株单糖组成分析表示重组菌在保留时间2.5 min有新的产物峰,且肠共同抗原(ECA)和克拉酸(CA)的存在可能会对分析过程造成干扰。因此选择MDCO001/pW菌株基础上删除共同抗原和克拉酸合成相关基因的菌株MDCO020/pW作为异源表达百日咳杆菌CS菌株FucNAc4NMe合成相关基因的宿主菌。(3)确定构建一系列由负责FucNAc4NMe转移的转移酶BplG与其他合成相关的基因不同组合的表达质粒得到多个合成FucNAc4NMe或其中间体的表达菌株。对重组菌进行了生理特性的分析,鉴定了脂多糖结构改变对细菌的影响。对脂多糖完整结构鉴定发现,BplL在FucNAc4NMe合成过程中具有重要作用,转移酶BplG不仅识别FucNAc4NMe,还可以识别合成过程的中间体进行转移。对MDCO020/pWpBR核心寡糖进行精细结构分析,确认单糖组成分析时的干扰来自于ECA和CA重复单元。并且证明了保留时间为2.5 min显示的峰代表外源表达产物。经NMR分析,鉴定了FucNAc4NMe在大肠杆菌中的合成,并总结一条FucNAc4NMe的生物合成转运途径。