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丙型肝炎病毒核心蛋白对双链RNA依赖蛋白激酶活性的影响

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中华肝脏病杂志 2014年第8期22卷 590-593页

作者：张丹冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳110021

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）活性的影响。方法将表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pCMH6K—Core转染人肝癌细胞系BEL-7402，应用干扰素（IFN）。α-2b诱导内源性PKR的表达及活化，利用Western blo... 详细信息

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）活性的影响。方法将表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pCMH6K—Core转染人肝癌细胞系BEL-7402，应用干扰素（IFN）。α-2b诱导内源性PKR的表达及活化，利用Western blot检测核心蛋白对PKR磷酸化的影响；将荧光素酶质粒pGL3-Promoter与不同剂量的pCMH6K—Core共转染BEL-7402细胞，进行荧光素酶活性检测，以反映核心蛋白对细胞蛋白合成的影响。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较用t检验或单因素方差分析。结果在IFNα-2b刺激下，表达HCV核心蛋白的BEL-7402细胞中，PKR的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组，而3组总PKR的表达水平无明显差别。在共转染荧光素酶质粒与核心蛋白表达质粒的BEL-7402细胞中，荧光素酶活性较共转染空白质粒组增强，且荧光素酶潘性的增高与核心蛋白的表达量呈剂量依赖效应，0．5μg、1．0μg和1．5μg的pCMH6K-Core转染组荧光素酶活性分别为空白质粒组的（1．941士0．199）倍、（2．868±0．275）倍和（3．839±0．338）倍，各组比较，P值均＜0．05。结论在人肝癌细胞系BEL-7402中，HCV核心蛋白能够抑制内源性PKR的活性，从而促进细胞蛋白合成。

关键词：肝炎病毒丙型病毒核心蛋白质类双链RNA依赖的蛋白激酶

丙型肝炎病毒核心蛋白对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的影响

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中华肝脏病杂志 2011年第10期19卷 751-754页

作者：刘兴晖周新祝成亮宋惠刘芳武汉大学中南医院基因诊断中心 430071 武汉大学人民医院检验科湖北医药学院附属东风医院检验科武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室

目的探讨HCV核心蛋白对低氧诱导因子1α【（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法将HCV核心蛋白基因的真核表达载体flag2B—core和HIF-1αsiRNA转染Huh7．5．1细胞；采用RT-PCR和Westernblot法分别检0n,0HIF～1α、VEG... 详细信息

目的探讨HCV核心蛋白对低氧诱导因子1α【（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法将HCV核心蛋白基因的真核表达载体flag2B—core和HIF-1αsiRNA转染Huh7．5．1细胞；采用RT-PCR和Westernblot法分别检0n,0HIF～1α、VEGF在mRNA和蛋白水平的表达变化，采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中VEGF的含量。对各组间数据进行t检验。结果Huh7．5．1细胞转染flag2B-core后，HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平升高，细胞上清液中VEGF含量明显高于对照组[（654．5±43．7）pg／ml与（365．9±26．8）pg／ml，t=653．1％，P〈0．01）]；Huh7．5．1细胞共转染flag2B—core和HIF-1asiRNA后，HIF-1a和VEGF的mRNA和蛋白表达水平降低，细胞上清液VEGF含量明显低于对照组[（389．2±29．6）pg／ml与（768．8±47．3）pg／ml，t=1330．22，P〈0．01）。结论HCV核心蛋白能够上调HIE-1α和VEGF的表达；HCV可能通过核心蛋白来调节HIF-1α和VEGF的表达。

关键词：肝炎病毒丙型病毒核心蛋白质类血管生成因子低氧诱导因子1α

乙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2．2．15细胞中的亚细胞定位及转移

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中华肝脏病杂志 2008年第1期16卷 29-32页

作者：潘孝本韩进超魏来彭丹丹高燕北京大学人民医院、北京大学肝病研究所 100044

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和... 详细信息

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和胞核中的HBcAg水平；选择性PCR检测胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平。结果二甲亚砜处理提高了胞质和胞核内的HBcAg表达及核内的cccDNA水平；Bay414109处理后胞质中HBcAg水平下降但胞核中HBcAg水平上升，cccDNA水平下降；联合应用二甲亚砜和Bay41—4109处理后HBsAg在胞质内呈条索状分布，胞质中HBcAg水平下降，但胞核内HBcAg明显上升，cccDNA水平下降。结论HepG2．2．15细胞中存在HBV核心颗粒入核障碍，游离核心蛋白易于通过核孔，二甲亚砜可促进核心蛋白进入细胞核，并有助于cccDNA的形成。

关键词：肝炎病毒乙型病毒核心蛋白质类二甲基亚砜 Bay41—4109

乙型肝炎病毒核心蛋白原蛋白转化酶切割假定产物的体外研究

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中华肝脏病杂志 2010年第8期18卷 595-598页

作者：程杰时红雷瑞祥彭晓谋广州市第八人民医院感染科 510060 中山大学附属第三医院感染科中山大学肝脏病医院肝脏病实验室

目的通过体外试验探讨furin切割核心蛋白的可能性,并通过重组载体表达,研究其假定产物在HepG2细胞内的分布特点. 方法重组HBV核心蛋白,并将其在不同温度和时间条件下（4℃消化16 h、30℃消化1h和30℃消化3h）接受furin切割,产物采用We... 详细信息

目的通过体外试验探讨furin切割核心蛋白的可能性,并通过重组载体表达,研究其假定产物在HepG2细胞内的分布特点. 方法重组HBV核心蛋白,并将其在不同温度和时间条件下（4℃消化16 h、30℃消化1h和30℃消化3h）接受furin切割,产物采用Western blot分析.构建HBV核心蛋白furin切割假定产物的真核表达载体,并以完整核心蛋白表达载体作为对照,转染HepG2细胞,获得稳定表达细胞株.使用核心蛋白与假定产物共同区的单克隆抗体进行间接免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察其细胞内分布. 结果 HBV核心蛋白在多种条件下均被furin切断,其主要产物相对分子质量约为15 000,与预期相符,且30℃切割1 h的效果最好.真核表达的核心抗原假定切割产物能与核心蛋白单克隆抗体结合,且在细胞内的分布与完整核心蛋白类似,主要以颗粒形式分布在细胞质. 结论 HBV核心蛋白在体外能被furin切割,其主要产物与完整核心蛋白有类似的免疫原性和相同的细胞内分布,提示furin或其家族成员参与了HBV复制调节,其切割产物对机体抗病毒免疫可能存在深远影响,值得深入研究.

关键词：肝炎病毒,乙型病毒核心蛋白质类显微镜检查,共焦原蛋白转化酶

丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子2相关酶1-AMP激活蛋白激酶信号通路活性致肝细胞能量代谢紊乱

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中华传染病杂志 2013年第2期31卷 71-76页

作者：于建武孙丽杰刘伟颜炳柱康鹏赵勇华哈尔滨医科大学附属第二医院感染病科科研实验中心150086

目的探讨沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）-AMP激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路在HCV核心蛋白所致肝细胞能量代谢紊乱中的作用。方法pcDNA3．1-core重组质粒转染HepG2细胞，流式细胞仪测定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞的活性氧（ROS）... 详细信息

目的探讨沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）-AMP激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路在HCV核心蛋白所致肝细胞能量代谢紊乱中的作用。方法pcDNA3．1-core重组质粒转染HepG2细胞，流式细胞仪测定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞的活性氧（ROS），液体闪烁计数仪测定ATP／ADP比例和AMPKa2酶活性，比色法测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态与还原态之比（NAD＋／NADH），荧光定量检测SIRT1酶活性，RT-PCR和Western印迹检测SIRT1、AMPKa2的表达。计量资料比较采用t检验。结果Western印迹检测证实，HepG2细胞表达相对分子质量为22000的HCV核心蛋白。与HepG2细胞相比，表达HCV核心蛋白的HepG2细胞ROS水平升高（1．0±0．1比4．0±0．5，t=14．411，P〈0．01）；ATP／ADP比例无明显变化（8．2±2．2比9．3±2．8，t=0．757，P〉0．05）；AMPKa2酶活性（0．8±0．2比0．2±0，t=7．345，P〈0．01）明显降低；NAD＋／NADH比例明显降低（0．08±0．02比0．024-0，t=7．348，P〈0．01）；SIRT1酶活性[（0．30±0．05）pmol·μg-1·min。比（0．15±0．04）pmol·μg-1·min，t=5．738，P〈0．01）]明显降低；SIRT1 mRNA（0．8±0．2比0．4±0．1，t=4．382，P〈0．01）和AMPKd2mRNA（0．9±0．3比0．2±0，t=5．715，P〈0．01）表达明显降低；SIRT1蛋白（0．8±0．2比0．3±0，t=5．941，P〈0．01）和磷酸化AMPK蛋白（0．5±0．1比0．1±0，t=9．608，P〈0．01）水平明显降低。结论HCV核心蛋白能下调SIRT1-AMPK信号通路活性，导致肝细胞能量代谢紊乱。

关键词：肝炎病毒属病毒核心蛋白质类能量代谢沉默信息调节因子2相关酶1 蛋白激酶类

蛋白激酶R与丙型肝炎病毒核心蛋白相互作用区域定位

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中国病理生理杂志 2007年第12期23卷 2410-2413页

作者：颜学兵季芳傅涓涓汪莉萍梅蕾潘修成韩方正张言超徐州医学院附属第一医院感染病科江苏徐州221002

目的:观察丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(CP)对蛋白激酶R(PKR)表达的影响;定位PKR与CP直接结合的区域。方法:对Huh-7、转染表达CP的Huh-7及含有全长HCV复制子(replicon)Huh-7细胞株的PKR表达水平及干扰素(IFN)诱导前后replicon Huh-7细胞中... 详细信息

目的:观察丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(CP)对蛋白激酶R(PKR)表达的影响;定位PKR与CP直接结合的区域。方法:对Huh-7、转染表达CP的Huh-7及含有全长HCV复制子(replicon)Huh-7细胞株的PKR表达水平及干扰素(IFN)诱导前后replicon Huh-7细胞中HCV结构蛋白和非结构蛋白表达水平作比较;对CP与PKR进行免疫共沉淀试验、谷胱苷肽S转移酶(GST)结合试验。结果:Replicon Huh-7中PKR表达水平高于Huh-7及转染表达CP的Huh-7;IFN诱导后PKR表达增加,且明显抑制HCV结构和非结构蛋白的表达;PKR能与CP直接结合,依赖于PKR的N端1-180氨基酸(aa)。结论:CP能直接作用于PKRN端1-180aa,导致PKR组成性激活,从而干扰PKR介导的相关信号转导通路。CP与PKR的相互作用是HCV病毒蛋白与细胞蛋白相互作用又一新的模式,在HCV持续感染及肝癌2者发病机制方面可能起重要作用。

关键词：肝炎病毒,丙型蛋白激酶R 病毒核心蛋白质类

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第4期20卷 355-357页

作者：孙丽杰李明荣于建武李树臣哈尔滨医科大学附属第二医院感染病科 150086

目的研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core protein,HCV-C)对HepG2细胞周期、细胞凋亡和p53蛋白表达的影响。方法表达HCV-C的真核表达质粒pcDNA3.1-core,通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞,经Wes... 详细信息

目的研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core protein,HCV-C)对HepG2细胞周期、细胞凋亡和p53蛋白表达的影响。方法表达HCV-C的真核表达质粒pcDNA3.1-core,通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞,经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞,经Western Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法,平板克隆实验和流式细胞术,蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果HCV-C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组;HCV-C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组;HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组;HCV-C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达,促进HepG2从G0/1期进入S期,促进细胞生长增殖,抑制细胞凋亡。

关键词：肝炎病毒病毒核心蛋白质类细胞周期细胞凋亡基因 p53

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

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解放军医学杂志 2004年第1期29卷 10-12页

作者：钟彦伟成军张忠东李强李莉陈菊梅解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心北京100039

目的　在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附洗脱扩增”的筛选 ,获... 详细信息

目的　在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附洗脱扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 (抗 Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果　筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论　HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。

关键词： C型肝炎样病毒属病毒核心蛋白质类抗独特型单链可变区抗体基因表达

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丙型肝炎病毒F蛋白克隆表达及其抗原性

中华传染病杂志 2008年第1期26卷 4-8页

作者：高得勇侯刚张欣欣金根娣孔晓飞张东华龚启明陆志檬上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科 200025

目的在原核表达系统中诱导表达1b型HCVF蛋白及Core蛋白，建立F抗体ELISA检测方法，对F蛋白在慢性丙型肝炎患者体内的抗原性作相关研究。方法应用RT-PCR方法从HCV感染者血清中获得Core蛋白编码基因，在第42位和144位人工增加或减少1个核... 详细信息

目的在原核表达系统中诱导表达1b型HCVF蛋白及Core蛋白，建立F抗体ELISA检测方法，对F蛋白在慢性丙型肝炎患者体内的抗原性作相关研究。方法应用RT-PCR方法从HCV感染者血清中获得Core蛋白编码基因，在第42位和144位人工增加或减少1个核苷酸，使其读码框移位，利用多重PCR技术拼接获得全长F蛋白的基因序列，分别构建编码F和Core蛋白的重组质粒。将鉴定正确的重组质粒转人大肠埃希菌BL21中，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达HCVCore和F蛋白。应用镍离子亲和层析树脂纯化蛋白，并用Western印迹法鉴定其免疫原性。建立ELISA检测方法对121例慢性丙型肝炎患者血清中抗F蛋白抗体进行检测。结果成功构建含HCVF蛋白、Core蛋白编码基因的重组克隆，表达纯化获得的HCVF蛋白和Core蛋白，Western印迹法鉴定并确定其特异性。121例慢性丙型肝炎患者血清中抗Core和抗F抗体的阳性率分别是93％和65％，而40例HBV感染者和40例健康对照者血清反应阴性。结论F蛋白在HCV自然感染中有表达，并能产生特异的免疫反应，其生物学功能及在HCV感染过程中的作用有待进一步研究。

关键词：肝炎病毒病毒融合蛋白质类克隆分子病毒核心蛋白质类基因表达