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猪外周血树突状细胞的体外培养及鉴定

中国兽医学报 2011年第9期31卷 1339-1342页

作者：张辉曹曼丽王贝贝蔡振东淮北师范大学生命科学学院安徽淮北235000

从猪外周血中分离获得单核细胞,分别加入150μg/L pGM-CSF和100U/mL pIL-4,体外培养6d后诱导出大量树突状细胞(Dendrictic cell,DC),通过显微镜观察,可见其细胞表面具有典型的树突状突起,呈毛刺状。在培养末期加入TNF-α后可促进DC进一... 详细信息

从猪外周血中分离获得单核细胞,分别加入150μg/L pGM-CSF和100U/mL pIL-4,体外培养6d后诱导出大量树突状细胞(Dendrictic cell,DC),通过显微镜观察,可见其细胞表面具有典型的树突状突起,呈毛刺状。在培养末期加入TNF-α后可促进DC进一步成熟,其表面高水平表达MHCⅡ、CD80/86和CD16。猪DC的体外获得将为进一步研究许多病毒性疾病的致病机理奠定的基础。

关键词：猪树突状细胞培养鉴定体外

MyD88siRNA诱导猪调节性树突状细胞的实验研究

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中国细胞生物学学报 2010年第3期32卷 415-421页

作者：周谦君范慧敏刘中民同济大学附属上海市东方医院中德心脏中心研究所上海200120 上海市第一人民医院胸外科上海200080

采用siRNA干扰猪外周血单核细胞来源DC(monocyte-derived DC,MoDC)髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因的表达,检测干扰前后的细胞表型,免疫学功能及生物学活性,探讨猪调节性DC诱导耐受的机制。提取猪外周血... 详细信息

采用siRNA干扰猪外周血单核细胞来源DC(monocyte-derived DC,MoDC)髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因的表达,检测干扰前后的细胞表型,免疫学功能及生物学活性,探讨猪调节性DC诱导耐受的机制。提取猪外周血单核细胞(peripheral bloodmonocyte,PBMC),经GM-CSF和IL-4诱导,体外培养得到未成熟MoDC。通过化学合成法制备针对MyD88基因siRNA 2对,在LipofectamineTM RNAiMax转染试剂介导下转染MoDC,Westernblot法及Real-time PCR检测干扰前后MyD88基因的表达水平。培养至第五天将DC分为四组:对照组、LPS组、干扰1组和干扰2组,继续培养3天。siRNA干扰后,MyD88 mRNA和蛋白质表达水平下降>80%;MyD88siRNA序列1和序列2干扰后MoDC CD80/86、SLA-Ⅱ表达降低,MLR显示刺激指数下降,IFN-γ降低,IL-4增高,与LPS组差异均具有统计学意义(P猪MoDC的MyD88基因,阻断TLR信号传导途径,抑制DC成熟,获得耐受性DC,表现为对同种异体T细胞的刺激能力降低,诱导免疫反应向Th2偏移。

关键词：猪树突状细胞 RNA干扰脂质体转染 MyD88

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

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江苏农业学报 2016年第3期32卷 588-592页

作者：刘芳乔艳艳薛洋杜芳芳张俊张红英王学兵河南农业大学牧医工程学院河南郑州450000 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450000

为建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(Mo DC)体外培养模型,从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-CSF)和白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)... 详细信息

为建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(Mo DC)体外培养模型,从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-CSF)和白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力。结果表明,经体外诱导的细胞具有典型的树突状形态;经脂多糖刺激的树突状细胞表型分子CD1a、CD80、CD86、SLAII、CD172a与未经刺激的树突状细胞有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力增强。本研究成功建立了猪Mo DC的体外诱导培养方法,为进一步研究其在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础。

关键词：猪外周血单核细胞猪树突状细胞表型分子诱导培养

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养（英文）

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Agricultural Science & Technology 2016年第10期17卷 2338-2342页

作者：乔艳艳薛洋闫延华杜芳芳张俊张红英王学兵河南农业大学牧医工程学院河南郑州450000 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450000

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型。[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rp IL-4)双因... 详细信息

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型。[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rp GM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rp IL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力。[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CD1a、CD80、CD86、SLAII、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强。[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础。

关键词：猪外周血单核细胞诱导猪树突状细胞表型分子

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猪肺炎支原体对猪鼻腔树突状细胞的影响

猪肺炎支原体对猪鼻腔树突状细胞的影响

作者：申育萌南京农业大学

学位级别：硕士

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,Mps)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)起的一种高度接触性、慢性、呼吸道传染病。患猪表现为阵发性的干咳,呼吸困难等临床症状,饲料转换率低,生长缓慢。我国Mps的发病率达... 详细信息

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,Mps)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)起的一种高度接触性、慢性、呼吸道传染病。患猪表现为阵发性的干咳,呼吸困难等临床症状,饲料转换率低,生长缓慢。我国Mps的发病率达30%～50%,感染率高达75%,该病的流行性给养殖业造成了严重的经济损失。Mhp主要定植于猪呼吸道上皮细胞纤毛,造成纤毛清除功能的损害,和上皮细胞的炎症反应。呼吸道上皮细胞下广泛着树突状细胞(Dendritic cells,DCs),DCs是目前已知的哺乳动物功能最强大的抗原递呈细胞,在识别抵抗病原微生物入侵,诱导机体产生适应性免疫过程中发挥重要作用。本试验首先对猪鼻腔DCs的分布进行定位,并体外分离猪骨髓源DCs,通过体内体外试验验证猪DCs与Mhp的相互作用,探究Mhp对猪DCs主要免疫功能的影响,为研究Mhp的发病机制及MMp疫苗研发奠定理论基础。1猪鼻腔及扁桃体树突状细胞的分布研究猪鼻腔和扁桃体是呼吸道最先接触抗原的部位,在动物体抵御病原微生物入侵过程中起重要作用。树突状细胞(DCs)是动物体内功能最强大的抗原递呈细胞,能有效的激活适应性免疫反应。人和小鼠鼻腔和扁桃体DCs已有研究报道,但猪鼻腔和扁桃体DCs的表型和分布仍不明确。因此,本试验选用MHCⅡ、CD11b和CD16三种猪DCs特异性抗体,对10头2月龄的杜长大三元杂交猪鼻腔、咽鼓管扁桃体、软腭扁桃体中的DCs进行标记,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜技术对分布于猪鼻腔和扁桃体内的DCs进行观察和分析。结果发现:猪鼻腔、咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体黏膜下固有层分布着CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs;咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体淋巴滤泡内也分布着CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs,且扁桃体固有层DCs数量是淋巴滤泡的3倍;健康状态下,猪鼻腔和扁桃体上皮细胞间DCs几乎没有分布;CD11b+DCs多分布于咽鼓管上皮细胞下方,仅有少量的CD11b+DCs可向上皮细胞方向伸出胞质突起。结果表明:猪鼻腔和扁桃体内分布着一定数量的CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs,有利于黏膜抗原的摄取和诱导免疫应答。2猪肺炎支原体对猪扁桃体和鼻腔树突状细胞及淋巴细胞的影响猪支原体肺炎(MMycooplasma hyopneumoniae,Mhp 是一种传染性慢性猪呼吸道疾病,日益危害养猪业的健康发展。Mhp是引起猪发生支原体肺炎的重要病原,飞沫经鼻腔传播是其主要传播途径。上呼吸道黏膜免疫细胞,如树突状细胞(DCs)和淋巴细胞,作为黏膜重要防线,在Mhp传播和感染过程中变化还不明确。因此,本研究应用荧光抗体双标的方法观察感染Mhp后鼻腔DCs、淋巴细胞、分泌型IgA阳性细胞的变化情况。结果发现:感染Mhp28天后,猪鼻腔CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs数量较正常对照组相比明显减少;鼻腔CD3+T细胞数量、分泌型IgA阳性细胞数量明显较正常对照组相比明显减少。结果表明:猪肺炎支原体感染导致鼻腔免疫细胞的数量减少,鼻腔黏膜免疫力下降,进而可能激发其他呼吸道病原微生物的感染。3猪肺炎支原体对体外培养猪骨髓源DCs免疫功能的影响DCs是机体唯一能激活幼稚型T细胞的抗原递呈细胞(Antigen presenting cell,APC),是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。DCs的成熟和递呈能力直接影响下游免疫应答水平。为了探究Mhp对DCs免疫功能的影响,本试验首先从仔猪骨髓中分离前体细胞,加入猪源GM-CSF和IL-4联合诱导其分化为DCs,并通过形态学、表面分子等对其进行鉴定。随后,Mhp-168株体外刺激DCs24小时,一部分DCs经流式细胞仪、定量PCR等方式对其表面分子的表达情况和细胞因子表达水平进行检测;另一部分DCs与异种淋巴细胞混合培养,检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示:Mhp-168株体外刺激DCs组与空白对照组相比显著抑制表面分子CD1a的表达,表面分子CD80/86表达情况不受影响,表面分子SLA-Ⅱ-DR表达上调;Mhp-168株体外刺激DCs组与空白对照组相比显著上调IL-10的表达水平,显著抑制IFN-γ的表达水平;Mhp-168株体外刺激DCs对淋巴细胞增殖没有影响。结果说明:Mhp-168抑制DCs的递呈和活化下游T细胞能力,诱导TH2型免疫反应。

关键词：猪肺炎支原体猪鼻腔猪树突状细胞黏膜免疫