猪肺炎支原体对猪鼻腔树突状细胞的影响
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：杨倩
授予年度：2016年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,Mps)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)起的一种高度接触性、慢性、呼吸道传染病。患猪表现为阵发性的干咳,呼吸困难等临床症状,饲料转换率低,生长缓慢。我国Mps的发病率达30%～50%,感染率高达75%,该病的流行性给养殖业造成了严重的经济损失。Mhp主要定植于猪呼吸道上皮细胞纤毛,造成纤毛清除功能的损害,和上皮细胞的炎症反应。呼吸道上皮细胞下广泛着树突状细胞(Dendritic cells,DCs),DCs是目前已知的哺乳动物功能最强大的抗原递呈细胞,在识别抵抗病原微生物入侵,诱导机体产生适应性免疫过程中发挥重要作用。本试验首先对猪鼻腔DCs的分布进行定位,并体外分离猪骨髓源DCs,通过体内体外试验验证猪DCs与Mhp的相互作用,探究Mhp对猪DCs主要免疫功能的影响,为研究Mhp的发病机制及MMp疫苗研发奠定理论基础。1猪鼻腔及扁桃体树突状细胞的分布研究猪鼻腔和扁桃体是呼吸道最先接触抗原的部位,在动物体抵御病原微生物入侵过程中起重要作用。树突状细胞(DCs)是动物体内功能最强大的抗原递呈细胞,能有效的激活适应性免疫反应。人和小鼠鼻腔和扁桃体DCs已有研究报道,但猪鼻腔和扁桃体DCs的表型和分布仍不明确。因此,本试验选用MHCⅡ、CD11b和CD16三种猪DCs特异性抗体,对10头2月龄的杜长大三元杂交猪鼻腔、咽鼓管扁桃体、软腭扁桃体中的DCs进行标记,应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜技术对分布于猪鼻腔和扁桃体内的DCs进行观察和分析。结果发现:猪鼻腔、咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体黏膜下固有层分布着CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs;咽鼓管扁桃体和软腭扁桃体淋巴滤泡内也分布着CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs,且扁桃体固有层DCs数量是淋巴滤泡的3倍;健康状态下,猪鼻腔和扁桃体上皮细胞间DCs几乎没有分布;CD11b+DCs多分布于咽鼓管上皮细胞下方,仅有少量的CD11b+DCs可向上皮细胞方向伸出胞质突起。结果表明:猪鼻腔和扁桃体内分布着一定数量的CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs,有利于黏膜抗原的摄取和诱导免疫应答。2猪肺炎支原体对猪扁桃体和鼻腔树突状细胞及淋巴细胞的影响猪支原体肺炎(MMycooplasma hyopneumoniae,Mhp 是一种传染性慢性猪呼吸道疾病,日益危害养猪业的健康发展。Mhp是引起猪发生支原体肺炎的重要病原,飞沫经鼻腔传播是其主要传播途径。上呼吸道黏膜免疫细胞,如树突状细胞(DCs)和淋巴细胞,作为黏膜重要防线,在Mhp传播和感染过程中变化还不明确。因此,本研究应用荧光抗体双标的方法观察感染Mhp后鼻腔DCs、淋巴细胞、分泌型IgA阳性细胞的变化情况。结果发现:感染Mhp28天后,猪鼻腔CD11b+CD16+DCs和CD11b+MHCⅡ+DCs数量较正常对照组相比明显减少;鼻腔CD3+T细胞数量、分泌型IgA阳性细胞数量明显较正常对照组相比明显减少。结果表明:猪肺炎支原体感染导致鼻腔免疫细胞的数量减少,鼻腔黏膜免疫力下降,进而可能激发其他呼吸道病原微生物的感染。3猪肺炎支原体对体外培养猪骨髓源DCs免疫功能的影响DCs是机体唯一能激活幼稚型T细胞的抗原递呈细胞(Antigen presenting cell,APC),是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。DCs的成熟和递呈能力直接影响下游免疫应答水平。为了探究Mhp对DCs免疫功能的影响,本试验首先从仔猪骨髓中分离前体细胞,加入猪源GM-CSF和IL-4联合诱导其分化为DCs,并通过形态学、表面分子等对其进行鉴定。随后,Mhp-168株体外刺激DCs24小时,一部分DCs经流式细胞仪、定量PCR等方式对其表面分子的表达情况和细胞因子表达水平进行检测;另一部分DCs与异种淋巴细胞混合培养,检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示:Mhp-168株体外刺激DCs组与空白对照组相比显著抑制表面分子CD1a的表达,表面分子CD80/86表达情况不受影响,表面分子SLA-Ⅱ-DR表达上调;Mhp-168株体外刺激DCs组与空白对照组相比显著上调IL-10的表达水平,显著抑制IFN-γ的表达水平;Mhp-168株体外刺激DCs对淋巴细胞增殖没有影响。结果说明:Mhp-168抑制DCs的递呈和活化下游T细胞能力,诱导TH2型免疫反应。
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