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基于特异性引物高效构建TALE文库

高校化学工程学报 2023年第6期37卷 943-950页

作者：蔡思杰张书衍王晓微郭显阳詹硕沈阳大学生命科学与工程学院辽宁沈阳110044 沈阳双鼎制药有限公司辽宁沈阳110179

人工构建的转录激活因子样效应物(TALE)已广泛应用于基因转录调控和基因组编辑领域,针对TALE构建过程非常复杂,研发了一种构建TALE文库的新方法。首先,基于金门酶切连接方法,设计3种用于识别碱基G的TALE骨架质粒;其次,使用4种特异性引... 详细信息

人工构建的转录激活因子样效应物(TALE)已广泛应用于基因转录调控和基因组编辑领域,针对TALE构建过程非常复杂,研发了一种构建TALE文库的新方法。首先,基于金门酶切连接方法,设计3种用于识别碱基G的TALE骨架质粒;其次,使用4种特异性引物扩增3种骨架质粒得到质粒突变体;最后,使用金门酶切连接方法连接3种质粒突变体,成功构建最终的TALE文库。基因测序结果表明该文库包含所有可能确定TALE-DNA结合特异性的核苷酸组。由于TALE的高靶向性和多功能性,该TALE文库将广泛用于生命科学领域。

关键词： TALE文库基因转录调控基因组编辑特异性引物金门酶切连接方法

耐酸乳酸杆菌物种特异性引物设计及其在古井贡酒窖泥酒醅质量评价中的初步应用

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食品与发酵工业 2019年第6期45卷 16-22页

作者：刘倩倩李俊薇曹润洁张会敏何宏魁李安军张治洲哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院山东威海264209 安徽古井贡酒股份有限公司安徽毫州236800

古井贡酒的酿造过程中,窖泥和酒醅中发现大量耐酵乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),对该菌快速特异性检测非常重要。该文利用L. acetotolerans菌及大量Lactobacillus类似菌种的全基因组序列与PRIMERBLAST方法,设计了几对L. acetotol... 详细信息

古井贡酒的酿造过程中,窖泥和酒醅中发现大量耐酵乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans),对该菌快速特异性检测非常重要。该文利用L. acetotolerans菌及大量Lactobacillus类似菌种的全基因组序列与PRIMERBLAST方法,设计了几对L. acetotolerans特异性引物,其中2对经过系列验证具有较好的特异性,可结合QPCR技术对不同质量和不同发酵阶段的窖泥进行L. acetotolerans含量的快速检测。结果表明,古井贡酒窖泥中L. acetotolerans含量总体明显低于酒醅,老窖泥中L. acetotolerans含量总体明显低于新窖池窖泥;而酒醅中老厂区和新厂区L. acetotolerans含量平均来看都很高,但样本之间存在明显波动。所用L. acetotolerans特异性引物可对浓香型白酒发酵样本中L. acetotolerans的相对含量测定并辅助评估窖泥酒醅质量。

关键词： Lactobacillus acetotolerans 古井贡酒特异性引物窖泥酒醅

广地龙特异性引物序列的设计及其混伪品的鉴别

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南京中医药大学学报 2020年第3期36卷 408-413页

作者：张前程文红梅刘娜袁琪刘睿崔小兵李松陈盛君南京中医药大学药学院江苏南京210023 江阴天江药业有限公司江苏江阴214434

目的通过设计特异性引物来鉴定广地龙及其混伪品。方法提取广地龙及其混伪品的DNA。利用通用引物COⅠ序列对广地龙及其混伪品进行PCR扩增,并对扩增产物进行双向测序。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,找出广地龙的变异位点,设计出... 详细信息

目的通过设计特异性引物来鉴定广地龙及其混伪品。方法提取广地龙及其混伪品的DNA。利用通用引物COⅠ序列对广地龙及其混伪品进行PCR扩增,并对扩增产物进行双向测序。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,找出广地龙的变异位点,设计出广地龙的特异性引物,用于广地龙及其混伪品的鉴定。对PCR反应条件退火温度、循环次数、DNA模板量和Taq酶用量进行适应性考察。结果COⅠ序列不存在特异性,不同物种、不同品种的动物药均可扩增出750 bp大小的片段,无法鉴定广地龙及其混伪品。通过比对广地龙及其混伪品的COⅠ序列,设计出广地龙的特异性引物PA-f/PA-r。在建立的PCR反应体系中,只有广地龙可以获得574 bp的基因片段,其他混伪品未扩增出相应条带。结论设计的广地龙特异性引物可以准确、成功鉴别广地龙,与其他混伪品区分,为广地龙的品种鉴别提供了有效的方法。

关键词：广地龙 DNA 特异性引物鉴别混伪品

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双歧杆菌属特异性定量引物的设计及验证

微生物学报 2020年第3期60卷 545-555页

作者：高旭白晓晔郑慧娟孙志宏张和平钟智内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010018 内蒙古农业大学农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古呼和浩特010018

【目的】旨在设计一对双歧杆菌属特异性引物以检测不同样品中低丰度双歧杆菌的含量。【方法】在NCBI中下载57株双歧杆菌全基因组序列,以其共有单拷贝核心基因为目的片段设计双歧杆菌属特异性引物;并对引物进行PCR初筛和特异性复筛;之后... 详细信息

【目的】旨在设计一对双歧杆菌属特异性引物以检测不同样品中低丰度双歧杆菌的含量。【方法】在NCBI中下载57株双歧杆菌全基因组序列,以其共有单拷贝核心基因为目的片段设计双歧杆菌属特异性引物;并对引物进行PCR初筛和特异性复筛;之后借助ddPCR(Droplet Digital PCR,微滴式数字PCR)依次对筛选出的引物进行特异性、灵敏度和实用性验证。【结果】引物Bif-D-9特异性最好,可扩增出4株双歧杆菌而不能扩增20株非双歧杆菌中的任何一株菌;同时通过ddPCR仪定量稀释后的DNA,其扩增结果呈线性下降趋势,证明其灵敏度较好;另外,Bif-D-9结合ddPCR定量出婴儿粪便中双歧杆菌的拷贝数为71 copies/μL,母亲粪便中双歧杆菌的拷贝数为2.7 copies/μL,证明了该方法的实用性。【结论】引物Bif-D-9具有双歧杆菌属特异性,且灵敏度较高、实用性较好,适用于复杂样品中双歧杆菌属定量。

关键词：双歧杆菌属特异性引物定量验证微滴式数字PCR

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烟草野火病菌特异性检测引物筛选及应用

中国烟草科学 2018年第1期39卷 72-76页

作者：陈瑞朋卢凯张敏刘元德宗浩牛纪军刘文涛徐后娟山东农业大学植物保护学院山东泰安271018 山东临沂烟草有限公司山东临沂276004

烟草野火病是山东烟区主要的细菌性病害之一,为了能够对该病害进行精确、快速的分子鉴定,本研究从NCBI基因组数据库中下载了假单胞菌属25个不同菌种和127个丁香假单胞菌属不同致病变种的全基因组数据,利用Mauve 2.3.1进行全基因组比对,... 详细信息

烟草野火病是山东烟区主要的细菌性病害之一,为了能够对该病害进行精确、快速的分子鉴定,本研究从NCBI基因组数据库中下载了假单胞菌属25个不同菌种和127个丁香假单胞菌属不同致病变种的全基因组数据,利用Mauve 2.3.1进行全基因组比对,获得丁香假单胞菌烟草致病变种特异性区段。在此基础上利用Primer Premier 6.0进行引物设计,筛选出了一对丁香假单胞菌烟草致病变种的特异性检测引物40429。利用7株山东不同烟区的烟草野火病菌和4株分别来自于贵州、湖北、福建及云南的烟草野火病菌进行了该引物的适用性验证,结果表明该引物均可扩增得到大小为203 bp的单一目的条带。说明该引物对于烟草野火病菌的检测具有良好的适用性,可以用于野火病菌的分子鉴定。

关键词：烟草野火病丁香假单胞菌烟草致病变种特异性引物分子鉴定

微纳米防污涂层表面真核菌群结构解析及特异性引物设计

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微纳米防污涂层表面真核菌群结构解析及特异性引物设计

作者：史宏伟哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

海洋生物污损问题已被认为是海洋相关结构和产业的重要障碍。基于表面微纳米结构和理化性质的综合防污技术近年来有不少报道。课题组前期研究初步发现微纳米改性涂层表面的生物膜样本中真核微生物群落多样性遭到破坏越是严重的涂层,其... 详细信息

海洋生物污损问题已被认为是海洋相关结构和产业的重要障碍。基于表面微纳米结构和理化性质的综合防污技术近年来有不少报道。课题组前期研究初步发现微纳米改性涂层表面的生物膜样本中真核微生物群落多样性遭到破坏越是严重的涂层,其防污性能的综合打分（依据海洋防污国家标准测定GB/T5370-2007《防污漆样板浅海浸泡试验方法》）也相对越高。推测纳米材料涂层可以通过影响其表面的真核生物群落多样性,重塑生物膜中各类生物群落之间的互作与交替过程,继而来影响污损生物幼虫的附着或生长。因此,本文进一步研究不同防污性能纳米材料不同基质改性涂层表面污损早期生物膜中真核群落的结构组成和差异。根据课题组前期研究选择防污性能好的和差的各7种纳米材料,分别与氯化橡胶铁红防锈漆和丙烯酸树脂漆混合制备浓度为1%（w/v）的微纳米改性涂层,加上不添加纳米材料的阴性对照共设计制备32个涂层。通过海洋实地挂板实验对钢板进行生物膜样本的采集。选取生物膜生长时间为4周的生物膜样本进行宏基因组DNA的提取和高通量全长测序,通过对18S和ITS（Internal Transcribed Spacer）序列的分析实现微纳米改性涂层表面生物膜中真核和真菌群落结构解析。同时利用ITS序列信息结合SAP（Simple Allele-discriminating Polymerase Chain Reaction）理论进行特异性引物设计、筛选及验证。最终设计成功的引物可用于样本中特定菌属的检测和定量。通过对高通量测序结果的Alpha多样性指数分析发现,在两种成膜物中,纳米材料的添加均起到了降低真核群落多样性、真核群落丰度以及真核群落谱系多样性的作用。而对于真菌群落来说,在氯化橡胶铁红防锈漆中纳米材料会降低涂层表面生物膜中真菌的OTU（operational taxonomic unit）数目。而在丙烯酸树脂漆中添加防污性能好的纳米材料使得生物膜中真菌OTU数目增大,而添加防污性能差的纳米管的涂层表面生物膜中真菌OTU数目小于阴性对照。不论选用何种成膜漆均是添加了防污性能差的纳米材料涂层表面生物膜中真菌丰度和谱系多样性低。总体来看,不管防污性能如何,壳吸管虫属Acineta都是细菌群落中的优势属。壳吸管虫属Acine在铁红阴性对照组中的相对含量比在微纳米-铁红防污性能好改性涂层中高10%,比在微纳米-铁红防污性能差改性涂层中低10%。壳吸管虫属Acine在微纳米-丙烯酸树脂改性组中,添加防污性能好的纳米材料使得其含量从15%暴增至83%,添加防污性能差的纳米材料使得其含量增加至66%。不同防污性能纳米材料的添加均使得壳吸管虫属Acineta含量大幅增加,增幅有差异但趋势一致。对于真菌而言,几种不同涂层表面生物膜中真菌群落结构差异相对较小。优势菌属为一种未被归类的真菌（Fungi unclassified）,在各个样本中的含量均大于80%,具有绝对优势。根据多参数聚类分析可知,除成膜物本身对真核生物群落具有一定影响外,纳米材料添加到不同成膜物中其产生的作用也不相同,不同防污性能纳米材料添加到氯化橡胶铁红防锈漆中产生的群落结构差异较大,而添加到丙烯酸树脂漆中其改变的群落结构差异则相对较小,因此,在设计海洋防污涂层时需同时考虑纳米材料与成膜物的作用情况而进行设计选择。利用高通量测序所得到的ITS序列信息确定SNP并结合SAP理论进行特异性引物设计。共设计27对引物对,覆盖13个OTU。最终成功设计12对特异性引物,覆盖5个OTU。特异性引物设计成功率达到44%,接近一半的引物均具有良好的特异性。可以用来检测和定量样本中的玻璃海鞘、拟菊海鞘以及鲍水母。

关键词：海洋污损生物膜高通量全长测序微生物群落特异性引物

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柴胡与狭叶柴胡的特异性引物PCR鉴别方法

时珍国医国药 2015年第2期26卷 370-372页

作者：薛英李晓伟邢婕张福生秦雪梅山西大学中医药现代研究中心山西太原030006 山西大学化学化工学院山西太原030006

目的设计专用于柴胡与狭叶柴胡鉴别的ARMS特异性引物,为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供分子鉴定依据。方法根据柴胡、狭叶柴胡与其他柴胡属植物的r DNA ITS序列,寻找柴胡与狭叶柴胡的序列特异性位点,设计用于进行柴胡与狭叶柴胡分子鉴别... 详细信息

目的设计专用于柴胡与狭叶柴胡鉴别的ARMS特异性引物,为柴胡、狭叶柴胡的药材鉴别提供分子鉴定依据。方法根据柴胡、狭叶柴胡与其他柴胡属植物的r DNA ITS序列,寻找柴胡与狭叶柴胡的序列特异性位点,设计用于进行柴胡与狭叶柴胡分子鉴别的特异性引物。结果该特异性引物为柴胡、狭叶柴胡的鉴别提供了分子鉴定依据,可从多种药材及中成药(蜜丸、水蜜丸)中快速、准确地检测出柴胡、狭叶柴胡。结论运用特异性引物PCR法能有效地从植物和中成药(蜜丸及水丸)中鉴别出柴胡与狭叶柴胡,该方法具有准确、高效、省时、简便的特点。

关键词：柴胡狭叶柴胡特异性引物 PCR 分子鉴别

基于特异性引物分子标记技术的大豆根腐病主要病原菌分子判别体系研究

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新疆农业科学 2012年第6期49卷 1086-1095页

作者：郑培娥郭庆元赵宗峰吴喜莲新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052

【目的】探索大豆根腐病主要病原菌分子检测方法,为复合侵染病害的进一步深入研究及大豆根腐病的科学防治奠定基础。【方法】采用病原菌rDNA-ITS区段序列分析对各病原菌种进行分子验证,采用病原菌特异性引物对大豆根腐病各病原菌种进行... 详细信息

【目的】探索大豆根腐病主要病原菌分子检测方法,为复合侵染病害的进一步深入研究及大豆根腐病的科学防治奠定基础。【方法】采用病原菌rDNA-ITS区段序列分析对各病原菌种进行分子验证,采用病原菌特异性引物对大豆根腐病各病原菌种进行分子标记,以特异性引物分子标记技术建立多病原的分子判别体系。【结果】通过序列比对使收集到的7种大豆根腐病致病菌(立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、尖孢镰孢霉、禾谷镰孢霉、茄腐镰孢霉和茄腐镰孢霉蓝色变种、燕麦镰孢霉)的鉴定结果得到分子验证;采用6种针对各病原菌种的引物(茄腐镰孢霉和茄腐镰孢霉蓝色变种为同一引物)进行的扩增实验均有特异性条带;经扩增条件优化和灵敏度检测初步建立针对大豆根腐病多种病原菌的分子判别体系。【结论】采用特异性引物分子标记技术基础上的病原菌分子判别体系可用于多病原复合侵染大豆根腐病的病原菌种类的分子判别,并为该病分子检测技术的建立奠定基础。

关键词：大豆根腐病特异性引物分子标记分子判别体系

柑桔炭疽菌果胶裂解酶pelB基因特异性引物的筛选

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广东农业科学 2012年第1期39卷 130-131,135页

作者：谭萍王勇姜于兰贵州大学农学院贵州贵阳550025

以柑桔炭疽菌为主要研究对象,根据已知的炭疽菌果胶裂解酶pelB基因序列,运用GenBank及Primer Premier 5共设计6对引物,其中编号为PB1/PB2、Cg1A/Cg1b及Cg2a/Cg2b的引物可扩增出pelB基因片段,经同源性分析,全序列与GenBank中登录号为GU47... 详细信息

以柑桔炭疽菌为主要研究对象,根据已知的炭疽菌果胶裂解酶pelB基因序列,运用GenBank及Primer Premier 5共设计6对引物,其中编号为PB1/PB2、Cg1A/Cg1b及Cg2a/Cg2b的引物可扩增出pelB基因片段,经同源性分析,全序列与GenBank中登录号为GU478342.1 pelB基因的的同源性高达98%,PB1/PB2、Cg1A/Cg1b对柑桔胶孢炭疽菌果胶裂解酶pelB基因有较高特异性。

关键词：胶孢炭疽菌果胶裂解酶特异性引物