微纳米防污涂层表面真核菌群结构解析及特异性引物设计

作     者：史宏伟 

作者单位：哈尔滨工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭长禄

授予年度：2020年

学科分类：08[工学] 082402[工学-轮机工程] 0824[工学-船舶与海洋工程] 0814[工学-土木工程] 

主      题：海洋污损 生物膜 高通量全长测序 微生物群落 特异性引物 

摘      要：海洋生物污损问题已被认为是海洋相关结构和产业的重要障碍。基于表面微纳米结构和理化性质的综合防污技术近年来有不少报道。课题组前期研究初步发现微纳米改性涂层表面的生物膜样本中真核微生物群落多样性遭到破坏越是严重的涂层,其防污性能的综合打分（依据海洋防污国家标准测定GB/T5370-2007《防污漆样板浅海浸泡试验方法》）也相对越高。推测纳米材料涂层可以通过影响其表面的真核生物群落多样性,重塑生物膜中各类生物群落之间的互作与交替过程,继而来影响污损生物幼虫的附着或生长。因此,本文进一步研究不同防污性能纳米材料不同基质改性涂层表面污损早期生物膜中真核群落的结构组成和差异。根据课题组前期研究选择防污性能好的和差的各7种纳米材料,分别与氯化橡胶铁红防锈漆和丙烯酸树脂漆混合制备浓度为1%（w/v）的微纳米改性涂层,加上不添加纳米材料的阴性对照共设计制备32个涂层。通过海洋实地挂板实验对钢板进行生物膜样本的采集。选取生物膜生长时间为4周的生物膜样本进行宏基因组DNA的提取和高通量全长测序,通过对18S和ITS（Internal Transcribed Spacer）序列的分析实现微纳米改性涂层表面生物膜中真核和真菌群落结构解析。同时利用ITS序列信息结合SAP（Simple Allele-discriminating Polymerase Chain Reaction）理论进行特异性引物设计、筛选及验证。最终设计成功的引物可用于样本中特定菌属的检测和定量。通过对高通量测序结果的Alpha多样性指数分析发现,在两种成膜物中,纳米材料的添加均起到了降低真核群落多样性、真核群落丰度以及真核群落谱系多样性的作用。而对于真菌群落来说,在氯化橡胶铁红防锈漆中纳米材料会降低涂层表面生物膜中真菌的OTU（operational taxonomic unit）数目。而在丙烯酸树脂漆中添加防污性能好的纳米材料使得生物膜中真菌OTU数目增大,而添加防污性能差的纳米管的涂层表面生物膜中真菌OTU数目小于阴性对照。不论选用何种成膜漆均是添加了防污性能差的纳米材料涂层表面生物膜中真菌丰度和谱系多样性低。总体来看,不管防污性能如何,壳吸管虫属Acineta都是细菌群落中的优势属。壳吸管虫属Acine在铁红阴性对照组中的相对含量比在微纳米-铁红防污性能好改性涂层中高10%,比在微纳米-铁红防污性能差改性涂层中低10%。壳吸管虫属Acine在微纳米-丙烯酸树脂改性组中,添加防污性能好的纳米材料使得其含量从15%暴增至83%,添加防污性能差的纳米材料使得其含量增加至66%。不同防污性能纳米材料的添加均使得壳吸管虫属Acineta含量大幅增加,增幅有差异但趋势一致。对于真菌而言,几种不同涂层表面生物膜中真菌群落结构差异相对较小。优势菌属为一种未被归类的真菌（Fungi unclassified）,在各个样本中的含量均大于80%,具有绝对优势。根据多参数聚类分析可知,除成膜物本身对真核生物群落具有一定影响外,纳米材料添加到不同成膜物中其产生的作用也不相同,不同防污性能纳米材料添加到氯化橡胶铁红防锈漆中产生的群落结构差异较大,而添加到丙烯酸树脂漆中其改变的群落结构差异则相对较小,因此,在设计海洋防污涂层时需同时考虑纳米材料与成膜物的作用情况而进行设计选择。利用高通量测序所得到的ITS序列信息确定SNP并结合SAP理论进行特异性引物设计。共设计27对引物对,覆盖13个OTU。最终成功设计12对特异性引物,覆盖5个OTU。特异性引物设计成功率达到44%,接近一半的引物均具有良好的特异性。可以用来检测和定量样本中的玻璃海鞘、拟菊海鞘以及鲍水母。