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中国水产科学 2006年第4期13卷 536-546页

作者：房保海郑法新孙修勤曲凌云张进兴中国海洋大学生命科学与技术学院 2. 国家海洋局第一海洋研究所

GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用。GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起(median eminence)末端,然后进入下丘脑垂体... 详细信息

GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用。GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起(median eminence)末端,然后进入下丘脑垂体门脉循环(hypothalamo?hypophyseal portal circulation)(四足动物)或直接通过轴突末梢(大多数硬骨鱼)把信号传递给刺激性腺的细胞,与特异性受体结合,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的合成与释放,参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能。伴随着GnRH的研究,研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国重要的海水养殖鱼类,本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的Type I GnRH受体,并对其组织特异性表达作了分析,为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础。在本研究中,以海水养殖牙鲆为材料,从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5’-和3’-RACE技术克隆得到了1 671 bp牙鲆促性腺激素释放激素受体(GnRH-R)全长cDNA序列,包括147 bp的5’-UTR、1 248 bp的开放阅读框和276 bp的3’-UTR,GenBank登录号是DQ011872。牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示,其存在许多保守的特征,牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域:1个N端胞外结构域(1~44个氨基酸残基)、1个大的跨膜结构域(45~324个氨基酸残基)和1个C端细胞质区域(325~415个氨基酸残基)。空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的。氨基酸序列系统进化分析表明,牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性)。已知的硬骨鱼GnRH-R基因的系统进化分析表明,存在两种类型的GnRH-R基因:TypeⅠGnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因。在牙鲆GnRH-R的氨基酸序列中,具有TypeⅠGnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TMⅢ)和DLEGKVSHSLTH(TMⅦ开始的序列处),表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type I GnRH-R。GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops,这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上。牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSAI(DRXXXI/V)基序,这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活;另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中(DPVIY),这个基序参与到一些GPCRs(包括GnRH-R)的内在化(internalization),同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用。在第三个胞内loop中,鱼类GnRH-R有个保守的Ala残基(在牙鲆中为Ala258),其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用。在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中,在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥,是受体的正确折叠必需的。和其他的GnRH-R一样,牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潜在的二硫桥。这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH-R对GnRH肽的选择性。GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守,但含有糖基化位点,是GnRH-Rs表达、GnRH-Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的。将mouse的GnRH-R糖基化位点引进到人GnRH-R中,可以增加受体的数量,但不影响受体结合力或肽选择性[25-26]。牙鲆TypeⅠGnRH-R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点(N100ITV和N178VTI),牙鲆TypeⅠGnRH-R含有的糖基化位点比哺乳动物要多,牙鲆糖基化位点的数目是否/怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力,应该进一步研究。在牙鲆GnRH-R的第一个胞内loop中,存在1个和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一致的基序(69KRKSH74),这个基序是Gs识别基序(BBXXB,B代表碱性氨基酸,X代表任何一种氨基酸)。已经证明这个基序和cAMP产生相关,cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提

关键词：牙鲆促性腺激素释放激素促性腺激素释放激素受体

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牙鲆抗迟缓爱德华菌病家系建立与抗病性能评价

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水产学报 2014年第11期38卷 1917-1925页

作者：张英平陈松林孙何军王磊范彩霞于洋张文婷杨英明张永珍田永胜邓寒陈红林刘肖峰吴娅红中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室上海海洋大学水产与生命学院河南师范大学水产学院

为筛选出抗迟缓爱德华菌的牙鲆家系,实验以已经选育出的牙鲆抗病和快速生长家系以及从韩国引进的选育群体为亲本建立了牙鲆家系56个,并对其中32个家系进行了迟缓爱德华菌人工感染实验。确定了迟缓爱德华菌对牙鲆家系的半致死浓度LD50为3... 详细信息

为筛选出抗迟缓爱德华菌的牙鲆家系,实验以已经选育出的牙鲆抗病和快速生长家系以及从韩国引进的选育群体为亲本建立了牙鲆家系56个,并对其中32个家系进行了迟缓爱德华菌人工感染实验。确定了迟缓爱德华菌对牙鲆家系的半致死浓度LD50为3.69×105CFU/mL后,从每个家系中随机抽取75尾,按照0.2 mL/10 g体质量腹腔注射半致死浓度的菌液,并设置1次重复。人工感染时水温控制在(19±1)℃。从32个家系中共选取4 800尾5月龄牙鲆幼鱼进行感染,16 d实验结束后统计各家系存活率为8.2%66.1%,平均存活率为31.2%。不同家系对迟缓爱德华菌的抗感染能力表现出显著差异(P牙鲆优良品系奠定了基础,对牙鲆抗细菌病的分子机理研究及抗病新品种选育具有重要意义和应用价值。

关键词：牙鲆迟缓爱德华菌家系抗病力选育

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牙鲆抗迟缓爱德华氏菌性状的遗传力和育种值分析

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农业生物技术学报 2016年第8期24卷 1181-1189页

作者：郑卫卫陈松林李泽宇位战飞高进李仰真刘洋田永胜刘寿堂孙德强杨英明王磊中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室上海海洋大学水产与生命学院海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室海阳市黄海水产有限公司

由于高密度工厂化养殖、海水污染等原因,牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖产业面临前所未有的危机,本研究以历年培育的抗病、速生牙鲆为亲本于2015年建立了57个家系,包括11个F3代和46个F4代家系。选择其中46个家系在146日龄和164日龄... 详细信息

由于高密度工厂化养殖、海水污染等原因,牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖产业面临前所未有的危机,本研究以历年培育的抗病、速生牙鲆为亲本于2015年建立了57个家系,包括11个F3代和46个F4代家系。选择其中46个家系在146日龄和164日龄分别进行迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染实验,配对样本t检验表明,两次实验无显著差异(P>0.05)。感染后的存活率分析表明,不同家系在抗迟缓爱德华氏菌的能力上存在显著差异(P牙鲆抗迟缓爱德华氏菌的抗病遗传力为0.177±0.020,为低遗传力,抗病性状选育适合家系选育。亲本抗病育种值变化范围为(-1.962±0.646)2.110±0.546,父母本育种值均较高的家系为F1551、F1550、F1501和F1505,其中,存活率最高的F1551家系的父母本育种值是所有家系父母本中最高的,表明具有良好抗病性能的F1551家系的父母本具有很好的育种性能。本研究通过家系选育、细菌感染实验及遗传参数和育种值分析,筛选出了抗病性强、生长速度快及父母本育种值高的家系,为培育抗病、生长快速牙鲆新品种提供了理论支持。

关键词：牙鲆迟缓爱德华氏菌家系存活率抗病遗传力育种值

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牙鲆(Paralichthys olivaceus)消化道形态学及组织学研究

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青岛海洋大学学报（自然科学版） 2001年第4期31卷 548-554页

作者：刘云姜国良郑家声青岛海洋大学海洋生命学院青岛266003

采用大体解剖及光镜技术研究了牙鲆消化道形态学和组织学。牙鲆消化道由口咽腔、食道、胃、小肠、幽门垂和直肠构成。牙鲆口咽腔较大 ,牙锥形 ,为颌齿 ,舌三角形 ,粘膜表面为复层扁平上皮 ;食道粘膜也衬着复层扁平上皮 ,在食道起始处存... 详细信息

采用大体解剖及光镜技术研究了牙鲆消化道形态学和组织学。牙鲆消化道由口咽腔、食道、胃、小肠、幽门垂和直肠构成。牙鲆口咽腔较大 ,牙锥形 ,为颌齿 ,舌三角形 ,粘膜表面为复层扁平上皮 ;食道粘膜也衬着复层扁平上皮 ,在食道起始处存在少量味蕾和较多的杯状细胞。由食道到胃 ,杯状细胞逐渐减少直至消失。肌肉也由横纹肌变成平滑肌。胃稍膨大 ,弯曲呈 J型 ,粘膜上皮为单层柱状上皮。贲门部、胃体和幽门部均有胃腺分布 ,尤以胃体处最多。小肠短 ,为体长的 1/ 2左右。小肠上皮为具微绒毛的单层柱状上皮 ,幽门垂 4个 ,无括约肌 ,组织结构与小肠相似。直肠粘膜上皮为假复层柱状上皮 ,粘膜上皮中散布着较多的杯状细胞 ,环肌比较发达。牙鲆的消化道组织特点表明 ,其消化过程的特性就是食物停留胃内的时间较短 ,因而牙鲆的进食间隙也较短。

关键词：牙鲆消化道形态学组织学胃食道口咽腔小肠幽门垂

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牙鲆微卫星标记的筛选及群体多态性分析

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中国水产科学 2005年第6期12卷 16-21页

作者：陈微张全启于海洋胡景杰齐洁包振民中国海洋大学生命科学与技术学部海洋生物遗传与种质工程研究室中国海洋大学生命科学与技术学部海洋生物遗传与种质工程研究室山东青岛266003

以牙鲆(Paralichthys olivaceusTemminck et Schlegel)为材料,基因组DNA经Sau3AⅠ进行部分酶切后,选取400~1 200 bp大小的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC19质粒中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,构建牙鲆酶切片段基因组文库。采用菌落杂交的... 详细信息

以牙鲆(Paralichthys olivaceusTemminck et Schlegel)为材料,基因组DNA经Sau3AⅠ进行部分酶切后,选取400~1 200 bp大小的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC19质粒中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,构建牙鲆酶切片段基因组文库。采用菌落杂交的方法,以(AC)10(、AG)10为探针从文库中筛选阳性克隆16个,共得到20个微卫星序列,其中完全型13个,不完全型5个,复合型2个。对其中18个进行引物设计,有11对引物扩增出目的片段,其中8对引物在群体中具有扩增多态性。在威海野生牙鲆30个个体中,各座位上得到的等位基因数为4~19个,观测杂合度(Ho)为0.413 8~0.965 5。其中有3对引物扩增的等位基因数超过17个,表现出高度多态性。本研究旨为进一步的牙鲆遗传多样性分析、家系分析及遗传图谱的构建等提供基础依据。

关键词：牙鲆菌落杂交微卫星多态性

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牙鲆家系亲权鉴定的微卫星DNA标记分析

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水产学报 2015年第11期39卷 1593-1603页

作者：刘永新孙朝徽王玉芬刘奕刘英杰中国水产科学研究院中国水产科学研究院北戴河中心实验站中国水产科学研究院珠江水产研究所

为准确进行不同家系的亲权鉴定,筛选具有高亲本排除概率的微卫星DNA标记,从牙鲆选育基础群体中挑选性腺发育良好的雌雄亲本各10尾建立全同胞家系10个,从独立饲养的每个家系中随机选取30尾个体组成系谱结构已知的家系群体,从混合培育的... 详细信息

为准确进行不同家系的亲权鉴定,筛选具有高亲本排除概率的微卫星DNA标记,从牙鲆选育基础群体中挑选性腺发育良好的雌雄亲本各10尾建立全同胞家系10个,从独立饲养的每个家系中随机选取30尾个体组成系谱结构已知的家系群体,从混合培育的子代群体中随机选取200尾个体组成系谱结构未知的混合群体。48个微卫星DNA标记选自牙鲆第二代遗传连锁图谱,且均匀分布于24个连锁群上,每个连锁群2个标记。家系群体的遗传分析结果发现,10个拥有丰富遗传多态性的微卫星DNA标记表现出高的亲本排除概率,其Excl 1和Excl 2的范围分别为0.6550.719和0.7920.837。随鉴定所用微卫星DNA标记数目的增加,累计排除概率逐步升高。当使用8个微卫星DNA标记鉴定时,累计排除概率达到100%。利用这些标记开展混合群体的亲权鉴定,显示共有13个雌雄个体参与繁殖过程,不同亲本配组产生的后代数量存在差异,亲本与后代群体之间的各项遗传学统计指标不存在明显差异。研究表明,筛选出具有高亲本排除概率的微卫星DNA标记能够有效进行牙鲆家系的亲权鉴定,可以作为今后开展家系选育与DNA分子标记联合育种的候选标记。

关键词：牙鲆微卫星家系亲权鉴定排除概率

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牙鲆生长抑素分泌细胞的免疫细胞化学研究

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中国水产科学 2007年第3期14卷 397-402页

作者：王静凤刘扬赵芹逄龙薛长湖中国海洋大学中国海洋大学山东青岛266003

采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫细胞化学染色技术,利用兔抗哺乳动物生长抑素血清对牙鲆(Paralichthys olivaceus)消化道(包括食道、胃、幽门垂、肠道全长及肛门)、肝胰脏、肾脏、脾脏以及生殖腺等器官的生长抑素(SS... 详细信息

采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫细胞化学染色技术,利用兔抗哺乳动物生长抑素血清对牙鲆(Paralichthys olivaceus)消化道(包括食道、胃、幽门垂、肠道全长及肛门)、肝胰脏、肾脏、脾脏以及生殖腺等器官的生长抑素(SS)分泌细胞进行定位和鉴别。结果表明,生长抑素分泌细胞仅存在于胃和胰岛中,其他检测部位均未见分布。在胃中,生长抑素分泌细胞主要散在分布于胃黏膜上皮、胃小凹底部上皮和胃腺的颈部周围。在胃的不同部位,生长抑素分泌细胞的分布密度存有差异,以胃体部数量最多,贲门部次之,幽门部最少。参照消化道内分泌细胞与胃肠腔或腺腔有无直接联系,以及基部有无胞质突起的分类方法,将SS分泌细胞分为4种不同的类型,这4种类型的SS分泌细胞在胃中均有出现,且不同部位出现的几率不同。其中,贲门部以第Ⅲ、Ⅰ型居多;胃体部以第Ⅳ、Ⅰ型细胞为主;幽门部仅有第Ⅰ、Ⅱ型细胞。提示,牙鲆的胃是一个复杂的内分泌器官。在胰脏中,生长抑素分泌细胞零散地分布于胰岛细胞之间,数量很少。

关键词：免疫细胞化学牙鲆生长抑素消化道胰岛

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牙鲆cbx2基因的分子特征与组织表达

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生物技术通报 2019年第4期35卷 69-75页

作者：王新艳张俊玲施志仪上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306 上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心上海201306

为鉴定牙鲆(Paralichthys olivaceus)色素框同源蛋白(Chromobox homolog,CBX)基因cbx2及探讨其在牙鲆性腺中的表达,通过PCR克隆和测序获得了cbx2 cDNA序列;利用多种生物信息学方法在线分析了牙鲆CBX2蛋白质的理化性质与空间结构,并比较... 详细信息

为鉴定牙鲆(Paralichthys olivaceus)色素框同源蛋白(Chromobox homolog,CBX)基因cbx2及探讨其在牙鲆性腺中的表达,通过PCR克隆和测序获得了cbx2 cDNA序列;利用多种生物信息学方法在线分析了牙鲆CBX2蛋白质的理化性质与空间结构,并比较了脊椎动物中cbx2的基因结构、氨基酸同源性、系统进化;运用RT-PCR技术分析了cbx2基因在牙鲆成体不同组织的表达情况。结果表明获得的牙鲆cbx2 cDNA序列包含1 584 bp的开放阅读框,编码527个氨基酸,其蛋白质分子量和等电点分别为56 578.98和10.03,是一种偏碱性的亲水性蛋白,该蛋白无信号肽,无跨膜区域,且编码该蛋白的氨基酸中以丝氨酸(Sr)的含量为最高;空间结构分析发现,牙鲆CBX2蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主,其二级结构中含有1个染色质结构域和4个低复杂结构域,该染色质结构域常结合甲基化氨基酸残基。基因结构、氨基酸同源性和系统进化分析表明cbx2基因在脊椎动物进化中较为保守,牙鲆cbx2与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、青鳉(Oryzias latipes)的基因结构更为相似,其氨基酸同源性与杜氏鰤(Seriola dumerili)最高,为89%。RT-PCR结果显示牙鲆cbx2基因在精巢的表达量最高,卵巢次之,而在其他组织中仅有较低的表达。这些结果提示了cbx2基因在牙鲆的性腺发育中可能具有重要作用。

关键词：牙鲆 cbx2 性腺生物信息学分析 RT-PCR

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牙鲆基因组（CAG）_n微卫星DNA特征分析

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中国水产科学 2009年第6期16卷 807-815页

作者：王蕾刘继红张立冬孙效文大连水产学院生命科学与技术学院中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

通过磁珠富集法筛选牙鲆(Paralichthys olivaceus)的微卫星分子标记,采用限制性内切酶Sau3A I对牙鲆完整基因组DNA进行酶切;通过蔗糖溶液梯度离心,收集400～900bp大小的片段,连接Brown接头,构建牙鲆基因组文库。用生物素标记的微卫星探... 详细信息

通过磁珠富集法筛选牙鲆(Paralichthys olivaceus)的微卫星分子标记,采用限制性内切酶Sau3A I对牙鲆完整基因组DNA进行酶切;通过蔗糖溶液梯度离心,收集400～900bp大小的片段,连接Brown接头,构建牙鲆基因组文库。用生物素标记的微卫星探针(CAG)15对基因组文库进行杂交,利用磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列,并对其进行PCR扩增;将扩增产物连接到pMD18-T载体后转入感受态大肠杆菌DH5α中,得到微卫星序列文库。利用大量质粒检测法进行二次筛选,成功地从牙鲆基因组中分离出含有CAG重复的微卫星序列,测序其中的3000个单菌落,获得2805个(占93.5%)含有微卫星序列的克隆,其中含有微卫星座位3120个,完美型1808个,占57.97%;非完美型226个,占7.25%;混合型1085个,占34.78%。从中选出186个微卫星序列设计120对引物并合成,经过筛选,74对引物可扩增清晰条带,其中68对呈多态性。

关键词：牙鲆微卫星磁珠富集

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牙鲆F_1代近交系、雌核发育系的建立及遗传检测

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海洋学报 2011年第3期33卷 114-123页

作者：田永胜汪娣王磊苗贵东邓寒陈松林中国水产科学研究院黄海水产水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点开放实验室山东青岛266071 青岛农业大学生命科学院山东青岛266109 中国海洋大学生命科学院山东青岛266003

在牙鲆育种中基于构建的大量家系,已经筛选出生长快成活率高的F1代家系0719,0750和0751,为了使其优良性状进一步纯化,采集以上3个优良家系中成熟个体的精子和卵子,分别利用家系内兄妹近交和鲈鱼冷冻精子诱导雌核发育的方式,构建了近交系... 详细信息

在牙鲆育种中基于构建的大量家系,已经筛选出生长快成活率高的F1代家系0719,0750和0751,为了使其优良性状进一步纯化,采集以上3个优良家系中成熟个体的精子和卵子,分别利用家系内兄妹近交和鲈鱼冷冻精子诱导雌核发育的方式,构建了近交系3个、雌核发育系7个,在其生长至127 d和190 d时,测定体长和体重两个性状,并利用方差分析、Student-Newman-Keuls多重比较及绝对增重比较等法对两个性状进行分析,发现0751的雌核发育系较其他近交系和雌核发育系生长更快(P牙鲆育种中具有较大的应用价值。

关键词：牙鲆近交系雌核发育系微卫星检测

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