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嗜麦芽窄食单胞菌热休克蛋白hsp70的表达、纯化及抗原性研究

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军事医学 2015年第3期39卷 229-231页

作者：许广杨尚学义汤雪萍钱垚姜永强李艳安徽医科大学解放军307医院临床学院合肥230032 解放军307医院重症医学科北京100071 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的验证嗜麦芽窄食单胞菌热休克蛋白hsp70(Dna K)的抗原性。方法以嗜麦芽窄食单胞菌K279a为模板,PCR扩增Dna K基因的全序列,将该序列连接到p ET-30a载体,转入大肠杆菌BL-21中,经1 mmol/L的IPTG 37℃诱导表达,目的蛋白纯化后进行Wester... 详细信息

目的验证嗜麦芽窄食单胞菌热休克蛋白hsp70(Dna K)的抗原性。方法以嗜麦芽窄食单胞菌K279a为模板,PCR扩增Dna K基因的全序列,将该序列连接到p ET-30a载体,转入大肠杆菌BL-21中,经1 mmol/L的IPTG 37℃诱导表达,目的蛋白纯化后进行Western印迹。结果与结论 Western印迹证实表达的重组蛋白能与鼠抗人hsp70单抗特异性结合,且与该菌的全菌免疫后血清有反应,而与免疫前血清无反应。嗜麦芽窄食单胞菌hsp70具有抗原性,可作为保护性抗原候选分子。

关键词：嗜麦芽窄食单胞菌热休克蛋白hsp70 重组蛋白抗原性

湿热壅滞型肛瘘术后苦参汤熏洗对热休克蛋白hsp70表达的影响

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按摩与康复医学 2014年第9期5卷 97-99页

作者：郝亮亮黄德铨陈敏康健杜勇军侯艳梅成都中医药大学附属医院肛肠科四川成都610031

目的：观察湿热壁滞型肛瘘患者手术后行苦参汤熏洗对热休克蛋白hsp70表达的影响。方法：将80例湿热壅滞型肛瘘患者随机分为治疗组（40例）和对照组（40例）。治疗组术后给予苦参汤坐浴，对照组则给予生理盐水坐浴，分别于治疗前及治疗后... 详细信息

目的：观察湿热壁滞型肛瘘患者手术后行苦参汤熏洗对热休克蛋白hsp70表达的影响。方法：将80例湿热壅滞型肛瘘患者随机分为治疗组（40例）和对照组（40例）。治疗组术后给予苦参汤坐浴，对照组则给予生理盐水坐浴，分别于治疗前及治疗后3天、7天和14天，以免疫组织化学方法检测、分析两组患者创面组织热休克蛋白hsp70的表达。结果：治疗组治疗后3天、7天和14天热休克蛋白hsp70表达均高于对照组（P＜O．01）。结论：肛瘘术后苦参汤熏洗可能是热休克蛋白hsp70表达的诱导因素之一，能明显增加热休克蛋白hsp70的表达。

关键词：肛瘘术后苦参汤湿热壅滞热休克蛋白hsp70

韭菜迟眼蕈蚊热休克蛋白Bohsp70的克隆及热胁迫下的表达分析

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应用昆虫学报 2021年第3期58卷 632-642页

作者：程佳旭付步礼李传仁张友军长江大学农学院荆州434025 中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081

【目的】本研究旨在克隆韭菜眼蕈蚊Bradysia odoriphaga热休克蛋白hsp70基因,并对其进行序列和表达模式分析,以及探讨该基因在韭菜迟眼蕈蚊生长发育及响应温度胁迫方面的作用。【方法】选择韭菜迟眼蕈蚊温度转录组中高温下表达上调的Hs... 详细信息

【目的】本研究旨在克隆韭菜眼蕈蚊Bradysia odoriphaga热休克蛋白hsp70基因,并对其进行序列和表达模式分析,以及探讨该基因在韭菜迟眼蕈蚊生长发育及响应温度胁迫方面的作用。【方法】选择韭菜迟眼蕈蚊温度转录组中高温下表达上调的hsp70序列,设计其基因引物扩增序列,构建qRT-PCR检测体系分析该虫在短时高温热激(30、32、34和36℃;1、2、4、6、8、10和12 h)和高温热激后不同恢复时间(25℃;1 h、2 h)下的hsp70表达谱。【结果】获得韭菜迟眼蕈蚊hsp70基因cDNA全长序列并命名为Bohsp70(GeneBank登录号:MW250640),包含1971 bp的开放阅读框,编码656个氨基酸,具有真核生物hsp70基因家族的3个保守序列,同时在C-末端具有KDEL序列,推测其属于内质网型热休克蛋白。BLAST分析和氨基酸序列系统发育分析结果显示,韭菜迟眼蕈蚊与双翅目蝇类昆虫hsp70聚类为一个分支。Bohsp70在韭菜迟眼蕈蚊体内不同发育阶段中都有表达,雄成虫体内的表达量高于雌成虫,且在雌雄成虫头部表达量的差异显著。高温胁迫可诱导Bohsp70表达,并在诱导1-2 h内达到最高水平。在30、32和34℃热激条件下随热激时间的增加,Bohsp70表达量呈下降趋势,而在36℃热激下,Bohsp70表达水平不变。韭菜迟眼蕈蚊在解除高温热激后,Bohsp70表达水平随着恢复时间的增长而下降。【结论】韭菜迟眼蕈蚊可以通过调节体内hsp70的表达来应对不良的环境温度。

关键词：韭菜迟眼蕈蚊高温胁迫热休克蛋白hsp70 昆虫耐热性

细粒棘球绦虫表膜糖抗原hsp70基因的克隆、表达及免疫特性分析

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新疆农业科学 2013年第5期50卷 949-958页

作者：古努尔.吐尔逊米晓云赵莉张旭张壮志石保新吐尔洪.依米提艾力麦麦提.麦麦提力马合木提.塔力普新疆畜牧科学院兽医研究所乌鲁木齐830000 乌鲁木齐米东区动物卫生监督所乌鲁木齐831400 乌鲁木齐市绒山羊研究所乌鲁木齐830000

【目的】克隆细粒棘球绦虫(Eg)表膜糖抗原的热休克蛋白70(hsp70)基因,构建原核表达载体,鉴定Eghsp70蛋白的免疫学特性。【方法】以Eg表膜糖抗原高免鼠血清为探针,从Eg成虫cDNA文库中筛选得到阳性克隆Eghsp70。构建Eghsp70基因的原核表... 详细信息

【目的】克隆细粒棘球绦虫(Eg)表膜糖抗原的热休克蛋白70(hsp70)基因,构建原核表达载体,鉴定Eghsp70蛋白的免疫学特性。【方法】以Eg表膜糖抗原高免鼠血清为探针,从Eg成虫cDNA文库中筛选得到阳性克隆Eghsp70。构建Eghsp70基因的原核表达载体pET28a-Eghsp70,诱导表达重组蛋白,纯化,免疫鼠,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测血清抗体效价、特异性及抗原在虫体组织中的位置。【结果】从Eg成虫cDNA文库中筛选获得特异性Eghsp70基因,酶切和测序结果均表明该基因已克隆到pET28a。Eghsp70融合蛋白在A600=0.6,0.4 mmol IPTG,37℃表达5 h为最佳表达。经His亲和层析法纯化获得了hsp70融合蛋白相对分子质量约为33 kDa。免疫小鼠可产生高滴度(最高1:640 000)特异性抗体。Westernblot分析结果表明,制备的抗血清与Eghsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、Eg虫体蛋白和Eg虫体表面蛋白均能特异性结合,其他带科绦虫有此蛋白表达IFA检测结果证实Eghsp70在细粒棘球绦虫成虫体表膜及体表内有表达。【结论】实验得到的Eghsp7O融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性,可用于研制包虫病疫苗及相关诊断试剂为包虫病的防控提供技术支持。

关键词：细粒棘球绦虫成虫cDNA文库细粒棘球绦虫表膜糖抗原热休克蛋白hsp70 Eghsp70融合蛋白免疫学特性

温度对卜氏晶囊轮虫寿命、MnSOD及hsp70基因表达的影响

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温度对卜氏晶囊轮虫寿命、MnSOD及hsp70基因表达的影响

作者：刘学洲南京师范大学

学位级别：硕士

轮虫是淡水水体重要的浮游动物类群,由于其对环境变化相当敏感,因此常被用于水域生态研究的指示生物。本试验中选取了卜氏晶囊轮虫(Asplanchna brightwelli)作为试验材料,研究了温度对卜氏晶囊轮虫生长发育的影响。并进一步克隆了卜氏... 详细信息

轮虫是淡水水体重要的浮游动物类群,由于其对环境变化相当敏感,因此常被用于水域生态研究的指示生物。本试验中选取了卜氏晶囊轮虫(Asplanchna brightwelli)作为试验材料,研究了温度对卜氏晶囊轮虫生长发育的影响。并进一步克隆了卜氏晶囊轮虫两种MnSOD基因的全长,利用Real time quantitative PCR检测了不同温度下线粒体MnSOD,细胞质MnSOD与hsp70 mRNA表达量之间的关系。尝试从传统生态学与分子生态学两个方面研究温度对具有捕食性的卜氏晶囊轮虫生长发育的影响,并探究这些基因的功能。本论文的研究内容有以下三个方面:1.温度对卜氏晶囊轮虫的寿命与繁殖的影响温度对卜氏晶囊轮虫的生长发育产生明显的影响。随着温度的升高,平均寿命、世代间隔、生殖前期、生殖期、生殖后期都呈缩短的趋势;平均后代只有在37℃(9.3 ±2.5)时才显著减少(P蛋白质分子量为25.2 kDa,没有信号肽,为线粒体蛋白;细胞质MnSOD基因全长941 bp,开放阅读框ORF为705 bp,编码234个氨基酸,蛋白质分子量为26.1 kDa,预测到有信号肽,是胞外蛋白。3.温度对卜氏晶囊轮虫MnSOD与hsp70基因表达的影响利用荧光定量分析结果显示:在低温(15℃)下,两种MnSOD基因都是经短暂的上调之后恢复到正常水平;30℃处理下,两种MnSOD的表达量都逐渐增加,在3h达到显著水平(Phsp70 mRNA的表达量逐渐增加,在暴露2h时,mRNA表达量检测值达到最大;当暴露在30℃下时,hsp70mRNA的表达量0.5 h迅速增加到2倍(Phsp70 mRNA表达量呈逐渐增加趋势并在3 h时达到最大值。

关键词：卜氏晶囊轮虫温度寿命繁殖 MnSOD 热休克蛋白hsp70

温度对萼花臂尾轮虫衰老过程中相关基因表达特征研究

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温度对萼花臂尾轮虫衰老过程中相关基因表达特征研究

作者：韩亚杰南京师范大学

学位级别：硕士

萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus Pallas)隶属于轮虫动物门(Rotifera),单巢纲(Monogononta),游泳目(Ploima),臂尾轮虫科(Brachionidae),是最常见的淡水浮游动物。由于其个体小(约100-500μm)、生命周期短(5-7d)、并且在实验室易于培养、衰老特征明显等特性,被认为是极具潜在价值的衰老生物学研究的模式生物之一。mTOR是一种高分子量的蛋白激酶,其响应细胞内的许多调节过程,包括有丝分裂及养分供应,其中S6K和S6基因为TOR信号通路的下游底物。而热休克蛋白(hsps)是一种小分子量蛋白,在机体受到胁迫时被诱导并出现应激效应。mTOR的磷酸化可促进hsp70伴侣复合物的释放,同时伴随着合成热休克蛋白的能力大幅度下降。但二者间的调节机制及其相互作用在轮虫衰老过程中的作用尚鲜有报道。本文通过研究不同温度对萼花臂尾轮虫(***)寿命,生殖量和生殖前期及生殖后期的影响;克隆TOR、S6K、S6和hsp70基因片段,并在不同温度不同时间处理后研究温度对其基因表达量的影响,以及研究高温和低温不同时间处理下的MnSOD,CAT和CuSOD基因表达变化量差异,为轮虫衰老生物学提供科学依据。1.温度对萼花臂尾轮虫寿命和生殖量的影响光照强度为4000lx,昼长比为(L:D)16:8,温度设置为15℃,20℃,25℃,30℃和35℃5个梯度组。结果发现,25℃培养轮虫时,轮虫的平均寿命为165.84±5.28h,15℃处理下轮虫的平均寿命为275.76±6.52 h,与25℃处理组相比,寿命延长效果显著(66.28%,P0.05)。2.温度对萼花臂尾轮虫TOR,S6K和S6与hsp70基因表达的影响自转录组获得TOR的基因片段为375bp,其编码125个氨基酸;S6基因片段为735bp,其编码245个氨基酸;S6K基因片段为951bp,其编码317个氨基酸;hsp70的基因片段2152bp,其编码656个氨基酸。利用实时荧光定量PCR技术检测TOR,S6K和S6三者与hsp70的基因表达变化量。结果显示前三者的基因表达量变化趋势基本一致,且与hsp70的基因表达变化在15℃,20℃,30℃,和35℃下都表现出明显的相互抑制趋势。具体表现为:前三者在15℃时,2h处理下,S6K基因表达量最高,约为对照组的0.65倍,此时hsp70的基因表达量约为对照组的6.5倍,差异性极显著(Phsp70的基因表达量约为对照组的5.3倍,差异性极显著(Phsp70的基因表达量均无显著差异(P>0.05);30℃时,经6h处理,前三者中TOR基因表达量最高,约为对照组的0.46倍,此时hsp70的基因表达量约为对照组的4.4倍,差异性极显著(Phsp70的表达量约为对照组的12倍,差异性也极显著(P<0.001)。3.温度对萼花臂尾轮虫CuSOD,CAT和MnSOD基因表达的影响本实验研究了萼花臂尾轮虫在低温15℃和高温35℃处理下CAT,MnSOD和CuSOD各基因的表达变化量变化。在15℃下,处理1h时,CAT的mRNA基因表达变化量最高,约为对照组的2.2倍(P<0.001),之后呈下降的趋势,在4h时基因恢复正常水平。15℃处理5h时,CuSOD和MnSOD的基因表达变化量最高,分别为对照的2.7倍和3.4倍(P<0.001)),CuSOD的基因表达量在前5h呈上升的趋势,6h时略有下降,但仍然高于对照,MnSOD的基因表达变化量在前5h也呈上升趋势,6h时恢复正常水平。在35℃下,处理1h和2h时,CAT的基因表达变化量最高,约为对照组的5.9和4.3倍(P<0.001),在5h时恢复正常水平,总体趋势呈逐渐下

关键词：温度萼花臂尾轮虫热休克蛋白hsp70 TOR SODs 荧光定量PCR

hsp70在先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞中的表达及意义

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现代中西医结合杂志 2015年第6期24卷 571-573,576页

作者：王萍蔡小军朱怡熊期张菁李朝辉余爱华武汉大学中南医院湖北武汉430071

目的探讨热休克蛋白(heat shock protein,hsp)70在先天性白内障小鼠模型晶状体上皮细胞中的表达及意义。方法先天性白内障BALB/c-Cat小鼠为实验组,正常BALB/c小鼠为对照组,每组16只。将实验组与对照组均各取8只分别进行Western blot蛋... 详细信息

目的探讨热休克蛋白(heat shock protein,hsp)70在先天性白内障小鼠模型晶状体上皮细胞中的表达及意义。方法先天性白内障BALB/c-Cat小鼠为实验组,正常BALB/c小鼠为对照组,每组16只。将实验组与对照组均各取8只分别进行Western blot蛋白印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小鼠眼睛晶状体上皮细胞中hsp70及hsp70基因的表达水平,以β-actin作为内参校正,比较2组间hsp70表达的差异。结果 hsp70在小鼠晶状体上皮细胞的相对表达值实验组为0.105 0±0.041 4,对照组为0.188 7±0.0236,2组比较差异有统计学意义(t=4.972 0,Phsp70基因的相对表达值实验组为0.131 3±0.003 5,对照组为0.334 0±0.004 2,2组比较差异有统计学意义(t=37.026,Phsp70在先天性白内障小鼠病情的发生、发展中能起一定的细胞保护作用。

关键词：先天性白内障晶状体上皮细胞热休克蛋白hsp70 BALB/c小鼠

利用噬菌体展示技术构建Mhp168株hsp70随机肽库

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生物技术 2020年第3期30卷 226-229,218页

作者：贾球锋毛晓娜李丽芳张映山西农业大学信息学院山西太谷030800 山西农业大学动物科技学院山西太谷030800

[目的]构建Mhp168株hsp70 C端基因的噬菌体展示随机肽库。[方法]扩增猪肺炎支原体168株热休克蛋白hsp70 C端1803 bp的DNA序列。回收hsp70 DNaseⅠ消化产物中80~150 bp的DNA片段与pC89载体连接。辅助噬菌体超感染转化重组噬粒的*** XL1-B... 详细信息

[目的]构建Mhp168株hsp70 C端基因的噬菌体展示随机肽库。[方法]扩增猪肺炎支原体168株热休克蛋白hsp70 C端1803 bp的DNA序列。回收hsp70 DNaseⅠ消化产物中80~150 bp的DNA片段与pC89载体连接。辅助噬菌体超感染转化重组噬粒的*** XL1-Blue细胞。检测肽库的多样性,测定库容。[结果]在噬菌体表面展示出hsp70 C端基因的随机片段融合蛋白。随机肽库库容约为9.9×10^3,滴度约为1.5×10^13 PFU/ml。[结论]所构建的随机肽库可以满足hsp70构象型抗原表位筛选。

关键词：猪肺炎支原体热休克蛋白hsp70 噬菌体肽库

细粒棘球蚴重组hsp70基因的表达、纯化及免疫学鉴定

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宁夏医学院学报 2008年第2期30卷 140-142页

作者：于晶晶于辛酉王娅娜师志云马锐卜阳罗永云赵巍宁夏医学院基础学院医学遗传学与细胞生物学教研室银川750004

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein,hsp70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒hsp70/pGEM-T中酶切hsp70目的片段,亚克隆入表达载体pET-28a,转化入大... 详细信息

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein,hsp70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒hsp70/pGEM-T中酶切hsp70目的片段,亚克隆入表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌*** BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。结果成功构建***70/pET-28a/*** BL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到***70均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。

关键词：细粒棘球蚴热休克蛋白hsp70 表达纯化免疫鉴定