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海参溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的整合及表达

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生物技术通报 2014年第4期30卷 139-146页

作者：李丹李成孙璐邹丹刘志文丛丽娜大连工业大学生物工程学院大连116034

采用枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)在体外表达海刺参溶菌酶(Stichopus japonicus lysozyme,SjLys)蛋白。通过构建克隆质粒pMD18-P43-SjLys,将***自身强启动子P43序列和已分离得到的SjLys基因(GenBank登录号EF036468)连接(P43-SjLys)。经BamH I/EcoR I酶切,将P43-SjLys片段连接到***整合载体pDG1730上,构建整合重组质粒pDG-P43-SjLys。经Xho I酶切处理,线性化的pDG-P43-SjLys质粒转化*** WB600细胞。P43-SjLys片段通过同源双交换重组整合到*** WB600染色体上,成功得到具有稳定遗传的基因工程菌*** WB600/P43-SjLys。经SDS-PAGE和抑菌试验分析表明,培养60 h后,*** WB600/P43-SjLys能够表达可溶的,对常见的海洋细菌溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性的SjLys蛋白。首次在***表达系统中得到可溶且具有酶活功能的SjLys蛋白,为SjLys的生产提出了一种具有可行性的和潜力的新方法。

关键词：海参溶菌酶枯草芽孢杆菌启动子P43 同源重组整合表达

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海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建

生物技术通报 2014年第6期30卷 150-154页

作者：孙璐刘志文邹丹李丹潘博丛丽娜大连工业大学生物工程学院大连116034

通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-S... 详细信息

通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段;重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致,外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响;在无选择压力的条件下,重组质粒的稳定性良好,连续传5次后的遗传稳定性为94%,并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。

关键词：基因重组海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌表达载体

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

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大连工业大学学报 2010年第5期29卷 317-320页

作者：谷跃峰丛丽娜骆宁大连工业大学生物与食品工程学院辽宁大连116034

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession ***036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因... 详细信息

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession ***036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。

关键词：海参溶菌酶毕赤酵母表达纯化

海参溶菌酶在毕赤酵母中的表达及生物活性研究

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海参溶菌酶在毕赤酵母中的表达及生物活性研究

作者：谷跃峰大连工业大学

学位级别：硕士

本论文旨在构建并筛选出具有抑菌活性的海参溶菌酶（Stichopus japonicusLysozyme，SJL）的毕赤酵母工程菌，并对表达产物进行纯化，研究了其理化特性及生物活性。利用Trizol试剂法从海参肠组织中提取总RNA，根据本实验室已经测得的SJL... 详细信息

本论文旨在构建并筛选出具有抑菌活性的海参溶菌酶（Stichopus japonicusLysozyme，SJL）的毕赤酵母工程菌，并对表达产物进行纯化，研究了其理化特性及生物活性。利用Trizol试剂法从海参肠组织中提取总RNA，根据本实验室已经测得的SJL的基因序列（GenBank accession No. EF036468）利用Primer Premier5.0软件设计引物，以总RNA为模板经一步法RT-PCR获得目的基因，并将该基因与表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pPIC9K-SJL，再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株，经甲醇诱导表达，上清液进行硫酸铵沉淀，透析后得到溶菌酶粗品。再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化，得到电泳纯的溶菌酶。利用浊度法测定该酶在不同pH和温度下的活性，以此来确定该酶的最适pH值、最适温度、pH稳定性及热稳定性。利用滤纸片液体扩散法测定重组海参溶菌酶的抑菌谱。重组质粒pPIC9K-SJL转化毕赤酵母GS115后经MD平板筛选出表型为His+的重组酵母菌株104株，然后经MD、MM平板确定其表型均为Muts，即甲醇利用缓慢型，最后由含4mg/mL抗生素G418的YPD平板筛选得到了31株高拷贝的溶菌酶基因工程菌，再经甲醇诱导表达筛选出7株具有抗菌活性的重组海参溶菌酶菌株。经硫酸铵沉淀法和CM52-纤维素阳离子交换柱纯化后，酶的比活力为26.9U/mg，总活力回收率为28.1%，纯化倍数为4.3倍。重组海参溶菌酶的最适pH为6.5，最适温度为35℃，在pH5.0～7.5范围内，50℃以下有较好的稳定性。抑菌谱测定结果显示重组海参溶菌酶对6种指示菌均表现出抑菌性，尤其对副溶血弧菌的抑制作用最强。结果表明SJL在毕赤酵母中得到成功表达，并通过离子交换层析得到了电泳纯的溶菌酶。

关键词：海参溶菌酶毕赤酵母表达纯化理化特性生物活性

海参溶菌酶和多肽在真核细胞中的表达及生物学活性研究

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海参溶菌酶和多肽在真核细胞中的表达及生物学活性研究

作者：姜启晨大连工业大学

学位级别：硕士

溶菌酶(Lysozyme, EC3.***.1.17),是一种碱性蛋白酶,专门作用于细菌的细胞壁,使细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键断裂,导致细菌细胞发生裂解,产生溶菌现象,从而起到杀死细菌的作用。它广泛存在于动植物和微... 详细信息

溶菌酶(Lysozyme, EC3.***.1.17),是一种碱性蛋白酶,专门作用于细菌的细胞壁,使细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键断裂,导致细菌细胞发生裂解,产生溶菌现象,从而起到杀死细菌的作用。它广泛存在于动植物和微生物的组织、体液及分泌物中,在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。根据分析海参i型溶菌酶基因结构,发现其完整基因中含有糖苷酶和异构肽活性,而研究推测海参溶菌酶的异构肽活性可能存在于海参溶菌酶C端区域。但利用基因工程手段将海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母系统中表达的文献还未曾出现,这对于海参i型溶菌酶的应用发展很不利,因此本研究旨在构建并筛选出具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(SjLys)和C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌。本研究根据实验室已构建好的pMD18-T-SjLys-C质粒,设计特异性引物,扩增出带有EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。同时,根据实验室已构建成功的海参溶菌酶全长片段表达质粒pPIC9K-SjLys,将其和C端片段重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,利用MM与MD培养基筛选出表型为His+Muts的菌株,再经1%甲醇诱导表达目的蛋白。结果显示,共筛选出6株具有抑菌活性的高拷贝重组海参溶菌酶基因工程菌和4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,重组海参溶菌酶和C端多肽酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,目的蛋白表达量最高,并且具有广谱杀菌作用,即对常见的革兰氏阳性革兰氏阴性指示菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。本研究成功将海参溶菌酶及其C端多肽在毕赤酵母中得到表达,研究为进一步研究海参溶菌酶结构与功能及其C端多肽在真核系统中的表达奠定了基础,也为今后的大规模的工业化生产提供了依据。

关键词：海参溶菌酶海参溶菌酶C端多肽毕赤酵母重组表达抑菌活性

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海参溶菌酶的基因结构与表达分析

海参溶菌酶的基因结构与表达分析

作者：常艺海大连工业大学

学位级别：硕士

海参i型溶菌酶与c型鸡蛋清溶菌酶相比较,它们的共同之处是都能水解革兰氏阳性细菌(G+),即催化这类细菌细胞壁中主要成分肽聚糖的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid, NAM)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, NAG)之间的p-1,4糖苷键... 详细信息

海参i型溶菌酶与c型鸡蛋清溶菌酶相比较,它们的共同之处是都能水解革兰氏阳性细菌(G+),即催化这类细菌细胞壁中主要成分肽聚糖的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid, NAM)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, NAG)之间的p-1,4糖苷键的水解,导致细胞裂解,内容物逸出而使细菌死亡。但是革兰氏阴性细菌(G-)细胞壁中肽聚糖成分含量很低,所以c型蛋清溶菌酶对G-细菌作用十分有限。但有研究报道,海参i型溶菌酶对G-细菌具有明显的抑菌作用。从基因结构和氨基酸序列分析发现,海参i型溶菌酶氨基酸成熟肽的氨基酸序列在26-65位之间可能具有糖苷酶的活性位点,而在80-125位之间可能具有异构肽酶的活性位点。但是利用基因重组技术高效表达可溶性海参溶菌酶及多肽的相关报道很少,这阻碍了对海参i型溶菌酶多功能性质的进一步探讨。因此,研究海参i型溶菌酶的的基因结构与表达分析,将为开发具有广谱抗菌活性的新型溶菌酶奠定理论基础。本研究从海参(Stichopus japonicus)中克隆得到与溶菌酶相关的三个目的基因,它们是海参溶菌酶全长基因(SjLys基因),海参溶菌酶N端基因(SjLys-N基因),以及海参C端基因(SjLys-C基因);其中SjLys、SjLys-N和SjLys-C基因分别指海参溶菌酶基因(GenBank accession no:EF036468)范围从307-681bp、307-465bp和466-681bp。因为海参溶菌酶基因编码125个成熟肽氨基酸,加上前20个信号肽的氨基酸,共编码145个氨基酸;当在重组表达时,SjLys、SjLys-N和SjLys-C基因分别编码了成熟肽的125个,50个和78个氨基酸。利用RNAiso Plus试剂从海参肠组织中提取总RNA,以本实验室发表的海参溶菌酶基因序列(GenBank accession ***036468)为模板,利用Primer Premier5.0软件设计三对特异性引物HS-Q-1和HS-Q-2, HS-N-1和HS-N-2及HS-C-1和HS-C-2;再以总RNA为模板经一步法RT-PCR分别扩增,得到目的基因SjLys, SjLys-N和SjLys-C。将上述目的基因连接到pET32a(+)上,构建重组表达质粒pET32a(+)-SjLys, pET32a(+)-SjLys-N和pET32a(+)-SjLys-C,再将这些质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中。分别挑取阳性克隆子,经IPTG诱导表达,并确定最佳诱导表达条件,即在LB液体培养基中添加终浓度为5g/L的葡萄糖,菌株的接种量为1%(v/v);在OD600为0.6,IPTG浓度为0.5mmol/L诱导温度为28℃的条件,分别诱导时间分别为15h、14h和10h。诱导发酵后的菌体经离心重悬后,超声破碎后再离心,各个组分经SDS-PAGE分析检测,结果发现重组蛋白SjLys (rSjLys)、SjLys-N (rSjLys-N)和SjLys-C (rSjLys-C)均能够以可溶性的形式表达,其中rSjLys、rSjLys-N和rSjLys-C表达量占总菌体蛋白的大约分别为48%、62%和80%,可溶性蛋白的表达量分别约占菌体总蛋白的10%、46%和70%左右。诱导后的表达的样品经Western Blotting分析鉴定,发现能够在目的蛋白的位置31kD、23kD及26kD附近与Penta-His Antibody有显色反应,证明目的重组蛋白都得到正确的表达。通过管碟法和抑菌谱实验,将纯化后rSjLys、rSjLys-N和rSjLys-C进行抑菌活性检测,确定它们的抑菌特性。结果发现,rSjLys对溶壁微球菌有活性,rSjLys-N和rSjLys-C对溶壁微球菌和副溶血弧菌都有抑菌活性,此夕卜rSjLys-C加热后对溶壁微球菌和副溶血弧菌的抑菌活性比加热前提高了5%～21%。上述结果表明,构建的重组海参溶菌酶及多肽的基因工程菌能够高效表达重组蛋白及多肽,产物具有可溶性和抑菌活性,这些产品将在水产养殖、畜禽养殖、食品加工、饲料添加剂等行业具有很大的开发潜力和市场应用价值。

关键词：海参溶菌酶重组蛋白SjLys 重组蛋白SjLys-N 重组蛋白SjLys-C 可溶性蛋白分离纯化抑菌活性

海参溶菌酶的功能、活性及其非酶抑菌活性位点的分析

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海参溶菌酶的功能、活性及其非酶抑菌活性位点的分析

作者：张齐大连工业大学

学位级别：硕士

海参是我国沿海城市重要的经济养殖物种,近年来,由于集约化养殖,导致其生存环境日益恶化,使海参病害问题日益严重。研究表明,海参在面对微生物感染时,会出现两条免疫应激策略。产生抗菌肽,如海参溶菌酶,通常情况下直接破坏病原菌机体;... 详细信息

海参是我国沿海城市重要的经济养殖物种,近年来,由于集约化养殖,导致其生存环境日益恶化,使海参病害问题日益严重。研究表明,海参在面对微生物感染时,会出现两条免疫应激策略。产生抗菌肽,如海参溶菌酶,通常情况下直接破坏病原菌机体;产生过量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)。但是,过量的ROS本身对机体具有严重的毒害作用。生物体的抗氧化防御系统(SOD和CAT),可以平衡ROS,维持机体的氧化还原平衡。因此深入研究海参的相关免疫机制,了解免疫相关蛋白的性质和功能将能有效增强海参抗病能力,对深入探讨仿刺参的抗氧化及免疫功能有着重要的作用。本研究主要深入讨论了海参溶菌酶及过氧化氢酶的作用和功能。在活体水平上,实验首次分析了海参i型溶菌酶在各个组织中的分布,初步确定了海参溶菌酶的免疫功能。研究发现,海参溶菌酶的量在触手中最多,呼吸树次之,而在肠中最少,体腔细胞和体壁中海参溶菌酶的量基本持平。灿烂弧菌免疫刺激后,海参体腔中的海参溶菌酶含量持续增加,在48 h时含量达到最多,之后海参溶菌酶含量会逐渐降低。在细胞水平上,利用基因沉默技术分析了海参i型溶菌酶对病原菌的免疫抑制作用。基因沉默后,体腔细胞的溶菌酶蛋白在转录水平上的表达被抑制了约50%,而在同等免疫条件下,离体培养的体腔细胞其凋亡和坏死情况明显加剧。在体外,本课题对溶菌酶的抑菌活性关键位点进行分析,结合定点突变技术从而确定海参i型溶菌酶的活性位点;实验利用肠激酶酶切技术,首次在体外对重组溶菌酶蛋白的标签Trx-His-S tag肽段进行切除,获得了非融合海参i型溶菌酶,并对溶菌酶的抑菌活性和异构肽酶活性进行了分析。实验中还构建海参过氧化氢酶原基因序列的重组大肠杆菌胞内表达基因工程菌,成功表达目的蛋白,优化表达条件。实验成功构建基因工程菌pET28c(+)-CAT/BL21(DE3),对其表达条件:时间、诱导物IPTG的量、温度、pH、转速进行了优化,确定了最优表达条件为诱导物 IPTG 量为 0.05mmol/L、pH7.4、250C、180rpm、诱导 6h。本研究为海参溶菌酶的深入研究开发和利用提供了很好的理论依据,并为海参过氧化氢酶今后的分离纯化及活性研究提供了理论基础。

关键词：海参溶菌酶肠激酶酶切表达纯化过氧化氢酶

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海参溶菌酶在酿酒酵母表达系统的构建及分析

海参溶菌酶在酿酒酵母表达系统的构建及分析

作者：随瑞瑞大连工业大学

学位级别：硕士

研究发现,海参i-型溶菌酶具有糖苷酶活性以及广谱、非酶抑菌活性。海参溶菌酶通过水解细胞壁上N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺间的β-1,4糖苷键裂解细菌细胞,可以有效地抑制水产养殖以及食品加工过程中的有害细菌。本实验采用酿酒酵母MK... 详细信息

研究发现,海参i-型溶菌酶具有糖苷酶活性以及广谱、非酶抑菌活性。海参溶菌酶通过水解细胞壁上N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺间的β-1,4糖苷键裂解细菌细胞,可以有效地抑制水产养殖以及食品加工过程中的有害细菌。本实验采用酿酒酵母MKP-0表达海参溶菌酶蛋白(Stichopus japonicus lysozyme,Sj Lys)。以实验室保存的克隆质粒p MD18-Sj Lys为模板,将His-tag标签克隆到海参溶菌酶基因的N末端,构建克隆载体p MD18-His6-Sj Lys。根据密码子偏好性分析,依次对Sj Lys蛋白的第69、77和95位精氨酸密码子通过定点突变进行优化,构建克隆载体p MD18-His6-Sj Lys((35)69,77,95)。通过Spe I/Bgl II双酶切,将His6-Sj Lys与His6-Sj Lys((35)69,77,95)目的片段分别连到酿酒酵母表达载体p ESC-LEU上,构建重组胞内表达载体p ESC-LEU-His6-Sj Lys和p ESC-LEU-His6-Sj Lys((35)69,77,95)。醋酸锂法将质粒分别转化至酿酒酵母MKP-0细胞。p ESC-LEU-His6-Sj Lys((35)69,77,95)/MKP-0通过2%半乳糖诱导60 h后,western blot检测成功表达Sj Lys目的蛋白。对半乳糖诱导时间进行梯度检测,结果发现诱导72 h后Sj Lys蛋白表达量最高。溶壁微球菌的牛津杯法抑菌实验和扫描电子显微镜观察的结果表明,酿酒酵母MKP-0细胞能成功表达具有抑菌活性的Sj Lys蛋白。但是,Sj Lys蛋白在酿酒酵母胞内的表达量比较低,所以又进行了酿酒酵母胞外分泌表达Sj Lys蛋白的研究。以实验室保存的含有MFα1信号肽的毕赤酵母表达载体p PIC9K为模板,PCR扩增MFα1片段并连接到p MD18-T上,得到克隆质粒p MD18-T-MFα1。经Not I/Spe I双酶切,将MFα1片段连接到p ESC-LEU-His6-Sj Lys((35)69,77,95)上。重组胞外分泌表达载体p ESC-LEU-MFα1-His6-Sj Lys((35)69,77,95)转化至酿酒酵母MKP-0中,构建海参溶菌酶胞外分泌表达系统。本实验首次在酿酒酵母中表达了具有活性的Sj Lys蛋白,为Sj Lys的生产提供了一种具有可行性的新方法。

关键词：海参溶菌酶酿酒酵母密码子优化信号肽表达

海参溶菌酶基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达

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海参溶菌酶基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达

作者：宋宛霖大连工业大学

学位级别：硕士

溶菌酶(lysozyme,EC3.***.1.17),又称胞壁质酶(muramidase)。根据免疫学特性、催化活性及空间结构,可以将溶菌酶分为六类。目前,国内外对溶菌酶的研究主要集中在c-型人溶菌酶以及c-型和i-型水产动物溶菌酶。研究发现,水产动物i-型溶菌酶... 详细信息

溶菌酶(lysozyme,EC3.***.1.17),又称胞壁质酶(muramidase)。根据免疫学特性、催化活性及空间结构,可以将溶菌酶分为六类。目前,国内外对溶菌酶的研究主要集中在c-型人溶菌酶以及c-型和i-型水产动物溶菌酶。研究发现,水产动物i-型溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有显著地抑菌效果,能够代替抗生素等抑菌产品,具有广泛的应用价值。但目前,产业化存在很大问题。实验多以大肠杆菌为表达宿主,但其表达容易出现包涵体且酶活较低。本实验将海参溶菌酶基因导入毕赤酵母中进行表达,克服了包涵体的问题,但是,蛋白表达量很低。为解决这个问题,本实验通过对海参溶菌酶基因密码子进行优化,提高表达量。本实验根据毕赤酵母特有的密码子偏好特性结合AT含量有效控制的方式改变基因,对基因密码子进行一定程度的优化并调整发酵条件来提高产量。实验中,将优化后的海参溶菌酶基因(SjLys’)经化学合成得到目的基因片段,再将带有海参溶菌酶基因的克隆载体pMD18-T-SjLys’,进行EcoRI和NotI双酶切处理,然后,构建到表达载体pPIC9K-SjLys’。新构建的表达载体转化至毕赤酵母GS115中,利用MD、MM固体培养基,筛选出具有甲醇缓慢表现型的菌株。将上述菌株,结合含1mg/mL～4mg/mLG418的YPD培养基,筛选高效表达的菌株,共256株,并具有抑菌活性。经1%甲醇诱导表达72h后,TCA沉淀处理发酵液,SDS-PAGE分析蛋白的表达,筛选出最优表达量的菌株 pPIC9K-SjLys’-8-27。本研究成功将优化的海参溶菌酶基因在毕赤酵母中得到重组表达。实验结果发现,通过对海参溶菌酶基因密码子优化后,蛋白表达量明显提高。研究为进一步研究海参溶菌酶结构与功能及其纯化奠定了基础,也为今后的大规模的工业化生产提供了依据。

关键词：海参溶菌酶密码子优化重组表达毕赤酵母抑菌活性