海参溶菌酶的基因结构与表达分析

作     者：常艺海 

作者单位：大连工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丛丽娜

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：海参溶菌酶 重组蛋白SjLys 重组蛋白SjLys-N 重组蛋白SjLys-C 可溶性蛋白 分离纯化 抑菌活性 

摘      要：海参i型溶菌酶与c型鸡蛋清溶菌酶相比较,它们的共同之处是都能水解革兰氏阳性细菌(G+),即催化这类细菌细胞壁中主要成分肽聚糖的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid, NAM)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, NAG)之间的p-1,4糖苷键的水解,导致细胞裂解,内容物逸出而使细菌死亡。但是革兰氏阴性细菌(G-)细胞壁中肽聚糖成分含量很低,所以c型蛋清溶菌酶对G-细菌作用十分有限。但有研究报道,海参i型溶菌酶对G-细菌具有明显的抑菌作用。从基因结构和氨基酸序列分析发现,海参i型溶菌酶氨基酸成熟肽的氨基酸序列在26-65位之间可能具有糖苷酶的活性位点,而在80-125位之间可能具有异构肽酶的活性位点。但是利用基因重组技术高效表达可溶性海参溶菌酶及多肽的相关报道很少,这阻碍了对海参i型溶菌酶多功能性质的进一步探讨。因此,研究海参i型溶菌酶的的基因结构与表达分析,将为开发具有广谱抗菌活性的新型溶菌酶奠定理论基础。 本研究从海参(Stichopus japonicus)中克隆得到与溶菌酶相关的三个目的基因,它们是海参溶菌酶全长基因(SjLys基因),海参溶菌酶N端基因(SjLys-N基因),以及海参C端基因(SjLys-C基因);其中SjLys、SjLys-N和SjLys-C基因分别指海参溶菌酶基因(GenBank accession no:EF036468)范围从307-681bp、307-465bp和466-681bp。因为海参溶菌酶基因编码125个成熟肽氨基酸,加上前20个信号肽的氨基酸,共编码145个氨基酸;当在重组表达时,SjLys、SjLys-N和SjLys-C基因分别编码了成熟肽的125个,50个和78个氨基酸。 利用RNAiso Plus试剂从海参肠组织中提取总RNA,以本实验室发表的海参溶菌酶基因序列(GenBank accession ***036468)为模板,利用Primer Premier5.0软件设计三对特异性引物HS-Q-1和HS-Q-2, HS-N-1和HS-N-2及HS-C-1和HS-C-2;再以总RNA为模板经一步法RT-PCR分别扩增,得到目的基因SjLys, SjLys-N和SjLys-C。将上述目的基因连接到pET32a(+)上,构建重组表达质粒pET32a(+)-SjLys, pET32a(+)-SjLys-N和pET32a(+)-SjLys-C,再将这些质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中。分别挑取阳性克隆子,经IPTG诱导表达,并确定最佳诱导表达条件,即在LB液体培养基中添加终浓度为5g/L的葡萄糖,菌株的接种量为1%(v/v);在OD600为0.6,IPTG浓度为0.5mmol/L诱导温度为28℃的条件,分别诱导时间分别为15h、14h和10h。诱导发酵后的菌体经离心重悬后,超声破碎后再离心,各个组分经SDS-PAGE分析检测,结果发现重组蛋白SjLys (rSjLys)、SjLys-N (rSjLys-N)和SjLys-C (rSjLys-C)均能够以可溶性的形式表达,其中rSjLys、rSjLys-N和rSjLys-C表达量占总菌体蛋白的大约分别为48%、62%和80%,可溶性蛋白的表达量分别约占菌体总蛋白的10%、46%和70%左右。诱导后的表达的样品经Western Blotting分析鉴定,发现能够在目的蛋白的位置31kD、23kD及26kD附近与Penta-His Antibody有显色反应,证明目的重组蛋白都得到正确的表达。 通过管碟法和抑菌谱实验,将纯化后rSjLys、rSjLys-N和rSjLys-C进行抑菌活性检测,确定它们的抑菌特性。结果发现,rSjLys对溶壁微球菌有活性,rSjLys-N和rSjLys-C对溶壁微球菌和副溶血弧菌都有抑菌活性,此夕卜rSjLys-C加热后对溶壁微球菌和副溶血弧菌的抑菌活性比加热前提高了5%～21%。上述结果表明,构建的重组海参溶菌酶及多肽的基因工程菌能够高效表达重组蛋白及多肽,产物具有可溶性和抑菌活性,这些产品将在水产养殖、畜禽养殖、食品加工、饲料添加剂等行业具有很大的开发潜力和市场应用价值。