海参溶菌酶在毕赤酵母中的表达及生物活性研究

作     者：谷跃峰 

作者单位：大连工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丛丽娜

授予年度：2010年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：海参溶菌酶 毕赤酵母 表达 纯化 理化特性 生物活性 

摘      要：本论文旨在构建并筛选出具有抑菌活性的海参溶菌酶（Stichopus japonicusLysozyme，SJL）的毕赤酵母工程菌，并对表达产物进行纯化，研究了其理化特性及生物活性。 利用Trizol试剂法从海参肠组织中提取总RNA，根据本实验室已经测得的SJL的基因序列（GenBank accession No. EF036468）利用Primer Premier5.0软件设计引物，以总RNA为模板经一步法RT-PCR获得目的基因，并将该基因与表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pPIC9K-SJL，再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株，经甲醇诱导表达，上清液进行硫酸铵沉淀，透析后得到溶菌酶粗品。再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化，得到电泳纯的溶菌酶。利用浊度法测定该酶在不同pH和温度下的活性，以此来确定该酶的最适pH值、最适温度、pH稳定性及热稳定性。利用滤纸片液体扩散法测定重组海参溶菌酶的抑菌谱。 重组质粒pPIC9K-SJL转化毕赤酵母GS115后经MD平板筛选出表型为His+的重组酵母菌株104株，然后经MD、MM平板确定其表型均为Muts，即甲醇利用缓慢型，最后由含4mg/mL抗生素G418的YPD平板筛选得到了31株高拷贝的溶菌酶基因工程菌，再经甲醇诱导表达筛选出7株具有抗菌活性的重组海参溶菌酶菌株。经硫酸铵沉淀法和CM52-纤维素阳离子交换柱纯化后，酶的比活力为26.9U/mg，总活力回收率为28.1%，纯化倍数为4.3倍。重组海参溶菌酶的最适pH为6.5，最适温度为35℃，在pH5.0～7.5范围内，50℃以下有较好的稳定性。抑菌谱测定结果显示重组海参溶菌酶对6种指示菌均表现出抑菌性，尤其对副溶血弧菌的抑制作用最强。 结果表明SJL在毕赤酵母中得到成功表达，并通过离子交换层析得到了电泳纯的溶菌酶。