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淀粉样融合蔗糖异构酶活性包涵体的异源表达及酶学性质表征

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大连工业大学学报 2022年第3期41卷 167-172页

作者：高向红王从纲庞焦李宪臻大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

为同步实现蔗糖异构酶(SIase)的异源表达和无载体固定化,采用融合表达制备出淀粉样融合蔗糖异构酶活性包涵体,并进行酶学性质分析。将SIase与酵母Ure2蛋白的N端淀粉样聚集片段(Ure2_(N))通过连接肽linker进行融合,构建表达载体pET 28a-U... 详细信息

为同步实现蔗糖异构酶(SIase)的异源表达和无载体固定化,采用融合表达制备出淀粉样融合蔗糖异构酶活性包涵体,并进行酶学性质分析。将SIase与酵母Ure2蛋白的N端淀粉样聚集片段(Ure2_(N))通过连接肽linker进行融合,构建表达载体pET 28a-Ure2_(N)-linker-SIase,并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。融合蛋白Ure2_(N)-linker-SIase主要以包涵体形式表达,采用TLC和HPLC检测产物,表明是一种活性包涵体,能催化蔗糖转化产生异麦芽酮糖。对该活性包涵体进行了酶学性质分析,结果表明,Ure2_(N)-linker-SIase活性包涵体在35~45℃、pH 5.0~6.5具有较高的相对酶活力,在35℃和pH 6.0具有最高酶活力,动力学常数K_(m)为(105.4±23.4)mmol/L,k_(cat)/K_(m)为(3.1±0.4)L/(mmol·min)。该活性包涵体有利于简化分离纯化步骤和促进蔗糖异构酶的重复利用,降低异麦芽酮糖的生产成本。

关键词：蔗糖异构酶活性包涵体异源表达酶学性质

土豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及其活性包涵体分析

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食品与药品 2012年第7期14卷 237-240页

作者：李小灵贺婉红范立强程安阳王刚潘忠孝朱庆庆孟军华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237

目的克隆、表达土豆环氧化物水解酶基因,分析其活性包涵体。方法提取土豆总RNA,以反转录获得的cDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR),扩增得到土豆环氧化物水解酶基因,构建大肠杆菌表达质粒***,将重组表达质粒pET–***转化*** BL21(DE3)... 详细信息

目的克隆、表达土豆环氧化物水解酶基因,分析其活性包涵体。方法提取土豆总RNA,以反转录获得的cDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR),扩增得到土豆环氧化物水解酶基因,构建大肠杆菌表达质粒***,将重组表达质粒pET–***转化*** BL21(DE3)。结果 SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导表达的重组土豆环氧化物水解酶在各种温度下均主要以包涵体形式表达,只在15℃有微量可溶表达。酶活性分析表明,28℃表达的重组酶包涵体酶活性性为0.7 U/mg。结论初步证实了存在活性包涵体的观点。

关键词：土豆环氧化物水解酶表达载体重组表达大肠杆菌活性包涵体

高效表达人DAAO活性包涵体用于玉米丝氨酸消旋酶活性分析

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高效表达人DAAO活性包涵体用于玉米丝氨酸消旋酶活性分析

作者：王蔚煜安徽农业大学

学位级别：硕士

D氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase,DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅酶,催化D型氨基酸的氧化脱氨反应,生成相应的丙酮、氨和过氧化氢的过氧化物酶。因为其广泛的底物特异性,真核生物的DAAOs广... 详细信息

D氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase,DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅酶,催化D型氨基酸的氧化脱氨反应,生成相应的丙酮、氨和过氧化氢的过氧化物酶。因为其广泛的底物特异性,真核生物的DAAOs广泛用于工业、医药、生物合成和分析等行业。表达活性包涵体(Inclusion bodies,IBs)是生产一种特殊的无载体固定化蛋白方法,具有产量高、稳定性好、易纯化等优点。在本实验中,我们构建不同人DAAO(hDAAO)基因,在大肠杆菌不同菌株中重组表达,比较不同构建体的不溶性DAAO蛋白的产量和活性,获得以下结果:1.构建hDAAO蛋白:克隆和合成编码hDAAO和密码子突变体基因,选取了四种融合标签,包括纤维素结合结构域、硫氧还蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和大肠杆菌起始因子IF2上游7个氨基酸组成的寡肽,融合野生型hDAAO,在标签和靶蛋白之间插入烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEVp)识别序列tevS(即ENLYFQG)。2.重组蛋白的表达和活性分析:将构建的表达载体分别在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中诱导表达,分析不同融合标签、rRNA丰度、tevS序列及密码子偏好性对其产量和活性的影响。结果表明,所有加入的标签或序列都影响hDAAO的产量和活性。其中密码子突变结合表达稀有密码子对提高hDAAO的产量和活性优于融合蛋白。3.底物特异性检测:hDAAO活性突变体催化三种D型氨基酸(D-丙氨酸、D-丝氨酸和D-天冬氨酸)的活性差异显示,不溶性聚集对底物专一性改变没有明显影响。4.偶联活性测定法分析玉米丝氨酸消旋酶的活性:将纯化的hDAAO密码子突变体蛋白和纯化的重组玉米丝氨酸消旋酶(Zea may serine racemase,ZmSR)混合,以L-丝氨酸为底物,测定hDAAO催化产物,结果显示,纯化的hDAAO活性包涵体比商业化分离的猪源DAAO效率高。综上所述,我们发现一种新型有效的利用N端密码子优化和共表达稀有tRNA生产hDAAO活性包涵体的方法,它有望用于将大肠杆菌表达折叠效率较低的蛋白或酶转变成活性包涵体。

关键词：活性包涵体 D-氨基酸氧化酶融合标签密码子偏好性玉米丝氨酸消旋酶

重组玉米和人丝氨酸消旋酶活性包涵体性质分析

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重组玉米和人丝氨酸消旋酶活性包涵体性质分析

作者：王如月安徽农业大学

学位级别：硕士

活性包涵体（IB）通常用作无载体固定化物以改善酶稳定性和使用效率,但很少研究含有催化多重反应的酶的IB的构象变化。丝氨酸消旋酶（SR;EC5.***.1.18）是一种独特的酶,催化L-丝氨酸（L-Ser）向D-丝氨酸（D-Ser）的可逆外消旋化和两种对... 详细信息

活性包涵体（IB）通常用作无载体固定化物以改善酶稳定性和使用效率,但很少研究含有催化多重反应的酶的IB的构象变化。丝氨酸消旋酶（SR;EC5.***.1.18）是一种独特的酶,催化L-丝氨酸（L-Ser）向D-丝氨酸（D-Ser）的可逆外消旋化和两种对映体通过脱水的不可逆的β-消除,导致维持D-Ser稳态体内。纯化的可溶性玉米SR（ZmSR）构建体的外消旋化和β-消除活性可通过添加甘油或二硫苏糖醇发生改变。IB中的ZmSR和人SR（hSR）没有表现出明显的β-消除活性,但保留了外消旋化活性。乙二醇或二硫苏糖醇增加不溶性ZmSR的外消旋化活性,而hSR结果不同。两种化合物对改变β-消除对不溶性聚集的ZmSR和hSR的活性没有明显影响。通过傅里叶变换红外光谱和刚果红和硫磺素T结合测定来研究SR构建体的构象。在本研究中,我们构建了可以使人SR基因在大肠杆菌中表达的载体,并在BL21（DE3）中过表达,从而进一步研究产量活性以及性质,结果如下:1)构建两种SR蛋白:人脑cDNA文库中克隆出hSR基因,同时构建含ZmSR的表达载体。并在表达的靶蛋白N端装有组氨酸标签。2)对重组SR蛋白的可溶性分析:构建的表达载体转入大肠杆菌表达株系BL21（DE3）中,分别在28℃中诱导12h,以及37℃诱导6h,利用SDS-PAGE检测蛋白表达分析不同温度下,不溶性蛋白的表达情况,其中较高温度使得不溶性蛋白表达增加。3)分析甘油、DTT对重组hSR蛋白的酶活影响:可溶性hSR的β消除活性很高,而不溶性hSR的β消除活性几乎丧失。对于不溶性的hSR来说,5mM DTT对外消旋活性有一定程度的抑制作用,甘油没有显著影响,而对于可溶性hSR来说,5mM DTT明显抑制对D-Ser外消旋能力以及β消除活性。而甘油对外消旋酶活没有显著影响。反映出来人SR包涵体的催化的特异性发生了改变。证实某些半胱氨酸残基参与调节SR构象。4)两种可溶性重组SR的性质分析:同样用DTT、甘油处理两种蛋白,在快速蛋白液相层析分析仪中（fast protein liquid chromatography,FPLC）装入 Superdex 200 Hiload 10/300GL预装柱,在280nm分析图谱,呈现单峰,计算可知全酶分子量大约为82KD,而DTT、甘油处理使得蛋白可溶性聚集被抑制。5)两种重组SR包涵体的形态分析:过表达获得两种SR包涵体,清晰纯化,利用透射电镜分析SR包涵体,可以发现两种SR的大小相似,为无规则的球形。6)两种重组SR包涵体的结构分析:利用FTIR以及ATR-FTIR分析可溶性以及不溶性SR的结果区别。在1615-1643cm-1,1647-1654cm-1和1650-1660cm-1附近的峰表示β折叠,无规则卷曲和α-螺旋构象。FTIR测定表明在两种SR蛋白包涵体中可以检测到二级结构。与可溶性SR相比,相应的不溶性SR的构象发生了变化。7)分析两种重组SR包涵体的聚集状态:利用刚果红以及硫代黄素T分别于SR包涵体反应,可以得知两种SR包涵体均为β淀粉样蛋白。综上所述,本研究证明了添加甘油和/或DTT对两种不溶性SR构建体的外消旋化和β-消除催化活性具有不同的影响。包涵体的不溶性聚集损害了构象灵活性,而天然β-折叠片层则使得SR包涵体还保留一定的酶活性。而构建的SR的活性IB可用于分析构象变化和反应特异性之间的关系,并且可用于产生D-Ser。

关键词：蛋白质聚集大肠杆菌丝氨酸消旋酶反应特异性活性包涵体

定点突变对烟草蚀斑病毒蛋白酶水溶性及其活性的影响

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定点突变对烟草蚀斑病毒蛋白酶水溶性及其活性的影响

作者：肖文俊安徽农业大学

学位级别：硕士

烟草蚀斑病毒蛋白酶（Tobacco etch virus protease,TEVp）能特异性识别融合标签和靶蛋白之间的氨基酸序列（ENLYFQG）,是常用的用于去除标签的工具酶。有研究表明在野生型TEVp中引入不同氨基酸突变对于其表达水平及酶切活性存在不同程... 详细信息

烟草蚀斑病毒蛋白酶（Tobacco etch virus protease,TEVp）能特异性识别融合标签和靶蛋白之间的氨基酸序列（ENLYFQG）,是常用的用于去除标签的工具酶。有研究表明在野生型TEVp中引入不同氨基酸突变对于其表达水平及酶切活性存在不同程度的影响。因此本研究以TEVp5M为对照,在分别引入K45F、E106G、K45F/E106G突变后,检测其表达水平及活性变化,并研究变性剂与蛋白水解酶对TEVp突变体的影响。1)通过提高稀有密码子丰富度,检测TEVp5M、及其三个突变体K45F、E106G、K45F/E106G的水溶性表达水平及活性差异。RossettaTM（DE3）菌株中E106G突变体的水溶性表达水平高于TEVp5M,而另两个突变体主要表达为包涵体。通过活性检测发现游离型的E106G突变体酶切活性高于对照,相反,另两种突变体切割活性较低。就包涵体而言,TEVp5M和E106G突变体活性明显高于K45F和K45F/E106G突变体。2)构建融合底物用于检测TEVp突变体在不同变性条件下的切割活性。通过荧光活性胶及酶耦联分析发现,在同等变性条件下游离型的E106G突变体活性比较TEVp5M高,两者形成的活性包涵体在变性条件中活性相对稳点,受变性剂浓度影响较小。3)分析游离态E106G突变体及其活性包涵体对蛋白水解酶的耐受性。SDS-PAGE检测发现活性包涵体相比于可溶性蛋白对蛋白水解酶具有更高的耐受性。4)探究引入E106G突变后对TEVp突变体M10、M12表达及活性的影响。研究发现引入E106G突变后提高了两者的可溶性表达,并对游离态M10突变体的活性有所提高,然而却降低了游离态M12-E106G突变体的活性。5)在N-末端融合自聚集短肽GFIL8提高了 TEVp5NM和E106G突变体包涵体的产量,但同时降低了切割活性。综上所述,该研究首次发现具有酶切活性的聚集态TEVp,并且发现E106G突变能够有效的提高TEVp在大肠杆菌的水溶性表达和酶切活性。此外活性包涵体比水溶性蛋白更加稳定,可替代水溶性蛋白酶在变性条件下去除融合标签。

关键词：烟草蚀斑病毒蛋白酶可溶态活性包涵体变性条件蛋白水解酶耐受性 GFIL8

两种固定化酵母Ulp1蛋白酶的性质研究及其比较

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两种固定化酵母Ulp1蛋白酶的性质研究及其比较

作者：蒋丽安徽农业大学

学位级别：硕士

酵母小泛素修饰蛋白(Small ubiquitin related modifier ubiquitin,SUMO3)作为融合标签被广泛用于提高靶蛋白在大肠杆菌的可溶性表达,Ubl特异性蛋白酶1(Ubl-specific protease 1,Ulp1)能特异性识别SUMO的空间结构并对其剪切可达到去除... 详细信息

酵母小泛素修饰蛋白(Small ubiquitin related modifier ubiquitin,SUMO3)作为融合标签被广泛用于提高靶蛋白在大肠杆菌的可溶性表达,Ubl特异性蛋白酶1(Ubl-specific protease 1,Ulp1)能特异性识别SUMO的空间结构并对其剪切可达到去除融合蛋白中的SUMO标签的目的,具有SUMO空间结构依赖性。大肠杆菌表达的重组Ulp1活性高于其它已报道的序列专一性蛋白酶,但由于产量较低,需要通过固定化提高酶的使用效率。本研究中,我们在形成活性包涵体的同义密码子突变体Ulp1蛋白N端融合了GFIL8疏水肽,以提高大肠杆菌内活性包涵体形式的无介质蛋白酶的产量;在Ulp1蛋白N端融合纤维素结合蛋白(CBM),通过将可溶性Ulp1蛋白酶定向固定在再生无定形纤维素(RAC)树脂上制备定向固定化酶,系统比较了这两种固定化酶的性质,获得以下结果:与定向固定的Ulp1相比,不溶性Ulp1对胰蛋白酶消化具有较高的抗性,低温度储存时泄漏量较低,但酶活性降低幅度较为严重。在进行过一次与蛋白底物的酶切反应后,包涵体Ulp1失去酶活性。新鲜制备和使用过一次的两种包涵体Ulp1在蛋白酶K消化、刚果红和硫代黄素T染料结合实验中所得结果具有相似性。使用戊二醛交联包涵体,发现包涵体Ulp1失活。由于两种固定化Ulp1蛋白酶各有优点,可在不同条件下用于体外去除SUMO标签从而释放靶蛋白,且利用离心可以简单快速去除酶切体系中的Ulp1。

关键词： Ulp1蛋白酶活性包涵体纤维素结合标签定向固定裂解活性

刚性多肽介导的葡萄糖脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶催化性能和组装特性研究

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刚性多肽介导的葡萄糖脱氢酶-亮氨酸脱氢酶融合酶催化性能和组装...

作者：廖浪星厦门大学

学位级别：硕士

L-叔亮氨酸（L-tert-leucine,L-tle）属于非蛋白原手性氨基酸,广泛应用于制药和食品行业,尤其是作为药物中间体在合成艾滋病毒蛋白抑制剂、抗癌、抗病毒药物等领域的应用。亮氨酸脱氢酶（LeuDH,EC 1.***.1.9）通过耦联葡萄糖脱氢酶（GDH,E... 详细信息

L-叔亮氨酸（L-tert-leucine,L-tle）属于非蛋白原手性氨基酸,广泛应用于制药和食品行业,尤其是作为药物中间体在合成艾滋病毒蛋白抑制剂、抗癌、抗病毒药物等领域的应用。亮氨酸脱氢酶（LeuDH,EC 1.***.1.9）通过耦联葡萄糖脱氢酶（GDH,EC 1.***.1.47）进行辅酶循环再生,可以催化三甲基丙酮酸制备手性纯的L-叔亮氨酸。受自然界多酶复合体具有高效快速催化反应和结构稳定性的启发,多酶融合耦联体系可能是一种提高L-叔亮氨酸生产效率的理想方法。本论文构建了用于L-叔亮氨酸合成的亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶融合酶体系,对其催化性能和组装特性进行了研究,主要完成了以下实验:一、重组大肠杆菌的构建。以pUC18-leudh和pUC18-gdh为模板分别扩增编码LeuDH和GDH蛋白的基因片段;以PCR产物leudh和gdh为模板,插入刚性多肽R3的编码基因,通过重叠延伸PCR方法融合基因片段得到gdh-r3-leudh;融合基因与pET-28a质粒载体双酶切后,连接得到重组质粒pET-28a-leudh-r3-gdh,此外构建了重组质粒 pET-28a-leudh和pET-28a-gdh;将上述3种重组质粒分别转化大肠杆菌,得到3株相应的重组大肠杆菌。二、酶的诱导表达与酶学性质研究。将构建的3株重组大肠杆菌扩大培养诱导重组蛋白表达,分别获得融合酶LeuDH-R3-GDH与游离酶LeuDH和GDH,然后利用His-Trap HP亲和镍柱纯化,蛋白通过SDS-PAGE分析,最后测定各自的比酶活。分别考察上述获得的融合酶和游离酶的动力学参数、最适pH和温度及热稳定性发现:（1）融合的GDH和LeuDH的Km值比游离的GDH和LeuDH的高、融合的GDH和LeuDH的kcat和kcat/Km值比游离的GDH和LeuDH的低,结果表明双酶融合后底物与酶的亲和力以及催化效率均有所降低;（2）游离的GDH最适pH为8.0,而融合的GDH在pH 6.0～9.0范围内维持80%以上的酶活,游离的GDH和LeuDH的最适温度均为70℃,而融合的GDH和LeuDH的最适温度均为80℃,结果显示融合酶具有更好的pH和稳定耐受性;（3）随着环境温度提高,融合酶酶活逐渐下降,融合的GDH在50℃孵育3 h仍保持40%的酶活,而游离的GDH在0.5 h后几乎失活,结果表明融合酶具有更高的热稳定性,这可能与刚性多肽和融合结构提高复合体结构稳定性有关。三、融合酶的催化性能研究。考察了融合酶状态、辅酶浓度、底物浓度以及其他反应条件对融合酶催化制备L-叔亮氨酸的影响,优化并放大了融合酶制备L-叔亮氨酸的催化体系。最适催化反应条件为:融合酶采用全细胞形式、NAD+浓度为0.4mM,底物浓度为500mM,30℃,pH9.0;采取上述优化后的催化反应条件,放大催化体系至200 mL,使用干重含量40 g/L的融合酶全细胞催化500 mM底物,反应0.5 h,生产强度可达到最高的2135.9 g/L/d,对应的L-叔亮氨酸得率为67.85%,e.e.值均大于99%。四、融合酶活性包涵体的催化性能研究。实验发现融合酶在胞内过表达可形成大量活性包涵体,70%的重组蛋白和超过85%的GDH和LeuDH酶活均分布于活性包涵体,且其表现出优于游离融合酶的催化性能;融合酶活性包涵体具有较好的可重复利用性,在连续6次回收催化后产物浓度仍保留首次催化得率的90%以上;采用了底物补料的方式,20 mL融合酶活性包涵体催化体系反应6 h,L-叔亮氨酸浓度达37.1 g/L,放大至200 mL催化体系后,反应24 h最终合成L-叔亮氨酸的浓度可达48.4 g/L。五、融合酶的组装特性研究。从融合酶组装过程分析,随着IPTG诱导融合酶蛋白表达的时间推进,活性包涵体的蛋白和酶活占比均逐渐提高;胞外融合酶浓缩提高蛋白浓度后会生成沉淀,其上清和沉淀的蛋白和酶活分布情况与胞内活性包涵体的表达结果相似;动态光散射分析发现融合酶粒径与蛋白浓度呈正相关关系,结果表明蛋白浓度的提高可促进融合酶自组装形成不溶性聚集体。从融合酶组装形态分析,扫描电镜观测结果发现融合酶活性包涵体组装形成规则结构,纯酶浓缩后的不溶性聚集体的形貌结构与活性包涵体类似,甚至组装形成更为规则的片层结构;原子力显微镜分析不溶性聚集体,发现其形成了组装的多层片状结构。结合胞内与胞外融合酶的组装过程与组装形态分析,推测活性包涵体及不溶性聚集体均是融合酶在高浓度蛋白情况下,由寡聚作用力介导的自组装行为所形成的超分子多酶复合体结构。

关键词：融合酶亮氨酸脱氢酶葡萄糖脱氢酶 L-叔亮氨酸活性包涵体

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HlyA60作为活性聚集标签的发现与应用

HlyA60作为活性聚集标签的发现与应用

作者：马佳媛华南理工大学

学位级别：硕士

大肠杆菌因其遗传背景清晰、基因操作工具多、兼容性好、生长速度快和易于扩大培养等优势,被作为异源表达重组蛋白的常用宿主。但在大肠杆菌中生产重组蛋白常常面临着表达受限、易受蛋白酶降解和低效纯化的问题,对用于生物催化的酶还需... 详细信息

大肠杆菌因其遗传背景清晰、基因操作工具多、兼容性好、生长速度快和易于扩大培养等优势,被作为异源表达重组蛋白的常用宿主。但在大肠杆菌中生产重组蛋白常常面临着表达受限、易受蛋白酶降解和低效纯化的问题,对用于生物催化的酶还需进行耗时费力的固定化操作。近年研究出现的活性聚集标签与目的蛋白融合表达形成活性包涵体的策略,为解决以上问题提供了一种新的思路。活性包涵体在重组蛋白的生产上表现出优异的性能,主要得益于其水不溶性。该方法介导的蛋白两步洗涤法,作为一种快速、经济、无柱化的纯化方法,可简化重组蛋白纯化过程,大幅度降低纯化成本。同时,活性聚集标签介导的原位固定化还能够达到与应用广泛的载体结合固定化达到相当的效果。本研究基于大肠杆菌I型分泌系统以mCherry作为分泌目标时效果不佳的现象,发现了目的蛋白在胞内以活性包涵体形式存在。通过不同I型分泌系统所需蛋白的组合对比,定位至具有活性聚集功能的基因hlyA218;进一步基因截短定位发现具有活性聚集功能的短肽HlyA60。结合结构预测及表面性质分析,初步推测了HlyA60通过静电相互作用两两吸引,以及通过疏水相互作用聚集形成更高级的管状或球状结构的活性聚集原理。HlyA60在与酶融合表达后,能够在大肠杆菌中有效地形成酶活性包涵体。其中乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterases,AXE)的融合蛋白AXE-HlyA60具有97.6%的包涵体形成率,且发酵末期菌体密度(OD)是对照菌株的1.91倍。与其他文献报道的活性聚集标签相比,HlyA60在保留AXE酶活力的同时,具有更好的“下拉”能力,且大幅度提高了菌株的生长速率和发酵密度。鉴于AXE-HlyA60的不溶性,采用两步洗涤法实现无柱化纯化,酶活性回收率达98.8%。原位固定化的AXE-HlyA60,实现30批次的循环催化的同时,仍保留了85.8%的酶活力。本研究发现了一个全新的可在大肠杆菌胞内诱导蛋白活性聚集的短肽HlyA60。研究表明,该短肽诱导蛋白活性聚集率高,且具有刺激重组菌快速生长的潜力。该短肽的发现,为活性聚集蛋白的应用拓展,提供了一个新的可能选择。

关键词：活性包涵体诱导聚集标签自组装肽蛋白纯化固定化