两种固定化酵母Ulp1蛋白酶的性质研究及其比较

作     者：蒋丽 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范军

授予年度：2018年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：Ulp1蛋白酶 活性包涵体 纤维素结合标签 定向固定 裂解活性 

摘      要：酵母小泛素修饰蛋白(Small ubiquitin related modifier ubiquitin,SUMO3)作为融合标签被广泛用于提高靶蛋白在大肠杆菌的可溶性表达,Ubl特异性蛋白酶1(Ubl-specific protease 1,Ulp1)能特异性识别SUMO的空间结构并对其剪切可达到去除融合蛋白中的SUMO标签的目的,具有SUMO空间结构依赖性。大肠杆菌表达的重组Ulp1活性高于其它已报道的序列专一性蛋白酶,但由于产量较低,需要通过固定化提高酶的使用效率。本研究中,我们在形成活性包涵体的同义密码子突变体Ulp1蛋白N端融合了GFIL8疏水肽,以提高大肠杆菌内活性包涵体形式的无介质蛋白酶的产量;在Ulp1蛋白N端融合纤维素结合蛋白(CBM),通过将可溶性Ulp1蛋白酶定向固定在再生无定形纤维素(RAC)树脂上制备定向固定化酶,系统比较了这两种固定化酶的性质,获得以下结果:与定向固定的Ulp1相比,不溶性Ulp1对胰蛋白酶消化具有较高的抗性,低温度储存时泄漏量较低,但酶活性降低幅度较为严重。在进行过一次与蛋白底物的酶切反应后,包涵体Ulp1失去酶活性。新鲜制备和使用过一次的两种包涵体Ulp1在蛋白酶K消化、刚果红和硫代黄素T染料结合实验中所得结果具有相似性。使用戊二醛交联包涵体,发现包涵体Ulp1失活。由于两种固定化Ulp1蛋白酶各有优点,可在不同条件下用于体外去除SUMO标签从而释放靶蛋白,且利用离心可以简单快速去除酶切体系中的Ulp1。