定点突变对烟草蚀斑病毒蛋白酶水溶性及其活性的影响

作     者：肖文俊 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范军

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：烟草蚀斑病毒蛋白酶 可溶态 活性包涵体 变性条件 蛋白水解酶耐受性 GFIL8 

摘      要：烟草蚀斑病毒蛋白酶（Tobacco etch virus protease,TEVp）能特异性识别融合标签和靶蛋白之间的氨基酸序列（ENLYFQG）,是常用的用于去除标签的工具酶。有研究表明在野生型TEVp中引入不同氨基酸突变对于其表达水平及酶切活性存在不同程度的影响。因此本研究以TEVp5M为对照,在分别引入K45F、E106G、K45F/E106G突变后,检测其表达水平及活性变化,并研究变性剂与蛋白水解酶对TEVp突变体的影响。1)通过提高稀有密码子丰富度,检测TEVp5M、及其三个突变体K45F、E106G、K45F/E106G的水溶性表达水平及活性差异。RossettaTM（DE3）菌株中E106G突变体的水溶性表达水平高于TEVp5M,而另两个突变体主要表达为包涵体。通过活性检测发现游离型的E106G突变体酶切活性高于对照,相反,另两种突变体切割活性较低。就包涵体而言,TEVp5M和E106G突变体活性明显高于K45F和K45F/E106G突变体。2)构建融合底物用于检测TEVp突变体在不同变性条件下的切割活性。通过荧光活性胶及酶耦联分析发现,在同等变性条件下游离型的E106G突变体活性比较TEVp5M高,两者形成的活性包涵体在变性条件中活性相对稳点,受变性剂浓度影响较小。3)分析游离态E106G突变体及其活性包涵体对蛋白水解酶的耐受性。SDS-PAGE检测发现活性包涵体相比于可溶性蛋白对蛋白水解酶具有更高的耐受性。4)探究引入E106G突变后对TEVp突变体M10、M12表达及活性的影响。研究发现引入E106G突变后提高了两者的可溶性表达,并对游离态M10突变体的活性有所提高,然而却降低了游离态M12-E106G突变体的活性。5)在N-末端融合自聚集短肽GFIL8提高了 TEVp5NM和E106G突变体包涵体的产量,但同时降低了切割活性。综上所述,该研究首次发现具有酶切活性的聚集态TEVp,并且发现E106G突变能够有效的提高TEVp在大肠杆菌的水溶性表达和酶切活性。此外活性包涵体比水溶性蛋白更加稳定,可替代水溶性蛋白酶在变性条件下去除融合标签。