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艳山姜挥发油调控PPARγ/ABCA1信号抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用机制

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中华中医药杂志 2022年第2期37卷 1118-1122页

作者：王声全张光琼甘诗泉肖潮达徐旖旎陈妍陶玲沈祥春贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室贵阳550025 贵州医科大学贵州省特色天然药物高效利用工程中心贵阳550025

目的:探讨艳山姜挥发油(EOFAZ)调控PPARγ/ABCA1抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用机制。方法:将THP-1细胞用佛波酯(PMA,100μg/L)诱导分化为巨噬细胞,噻唑蓝(MTT)法检测EOFAZ对巨噬细胞活力的影响。油... 详细信息

目的:探讨艳山姜挥发油(EOFAZ)调控PPARγ/ABCA1抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞形成的作用机制。方法:将THP-1细胞用佛波酯(PMA,100μg/L)诱导分化为巨噬细胞,噻唑蓝(MTT)法检测EOFAZ对巨噬细胞活力的影响。油红O染色法检测脂滴的含量;酶法检测总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)的含量,并计算胆固醇酯(CE)的含量和占比值;qRT-PCR和Western Blot法分析巨噬细胞中PPARγ、ABCA1 mRNA和蛋白的表达。采用PPARγ的抑制剂GW9662作为反向探针,分析PPARγ、ABCA1 mRNA和蛋白质的表达,以及脂滴累积情况。结果:EOFAZ在0.2~5μg/L对巨噬细胞无明显毒性,EOFAZ低、高剂量(1、5μg/L)可显著减少巨噬细胞内脂滴的累积,TC和CE的含量,以及CE/TC比值(P细胞源性泡沫细胞的形成具有抑制作用,其作用机制与促进PPARγ表达上调密切相关。

关键词：艳山姜挥发油氧化低密度脂蛋白泡沫细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 动脉粥样硬化

Liraglutide reduces oxidized LDL-induced oxidative stress and fatty degen- eration in Raw 264.7 cells involving the AMPK/SREBP1 pathway

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Journal of Geriatric Cardiology 2015年第4期12卷 410-416页

作者： Yan-Gui WANG Tian-Lun YANG Department of Cardiology Xiangya Hospital Central South University No. 8 7 Xiangya Road Changsha Hunan China Deparment of Geriatrics Hunan Provincial People's Hospital No.61 Jiefang West Road Changsha Hunan China

BackgoundRecent 研究在动脉粥样硬化患者的预防和稳定为 liraglutide 建议了一个潜在的角色脉管的疾病。然而，在动脉粥样硬化上位于 liraglutide 的效果下面的分子的机制很好没被阐明。这研究的目的是检验 liraglutide 是否经由 AMP-a... 详细信息

BackgoundRecent 研究在动脉粥样硬化患者的预防和稳定为 liraglutide 建议了一个潜在的角色脉管的疾病。然而，在动脉粥样硬化上位于 liraglutide 的效果下面的分子的机制很好没被阐明。这研究的目的是检验 liraglutide 是否经由 AMP-activated 的调整免于氧化应力和丰满的退化； protein ； kinase ( AMPK ) /sterol 规章的元素绑定抄写因素 1 ( SREBP1 )在泡沫 cells.MethodsMouse 巨噬细胞 Raw264.7 房间表明小径暴露于氧化低密度脂蛋白( oxLDL )导致泡沫房间的形成。房间与 oxLDL 被孵化(50 µ； g/mL ) ， liraglutide (0.1， 0.5， 1 和 2 nmol/L ) 或 exendin-3 (9-39 )(1， 10 和 100 nmol/L ) 独自，或在里面联合。染色的油红 O 被用来检测细胞内部的类脂化合物微滴。TG 和胆固醇的层次用商业工具包被测量。氧化应力被测量细胞内部的反应的氧种类(ROS ) 决定， malondialdehyde (MDA ) 和 superoxide dismutase 1 (草皮) 。西方的污点分析被用来检验 AMPKα 的表示； 1 ， SREBP1 ， phosphorylated AMPKα ； 1 ， phosphorylated SREBP1 ，象glucagon一样 peptide-1 ( GLP-1 )和 GLP-1 染色的受体( GLP-1R ) .ResultsOil 红 O 证明细胞质的类脂化合物微滴累积被处理显然与 liraglutide 在泡沫房间减少。在对待 liraglutide 的泡沫房间的 TG 和胆固醇内容显著地被减少。另外，泡沫房间表明了一个损害氧化压力追随者 liraglutide 处理，证实了由增加的草皮，和减少的 ROS 和 MDA。然而，泡沫房间上的 liraglutide 的这些效果被 GLP-1R 对手 exendin-3 (9-39 ) 的使用稀释。而且，我们发现表示 AMPKα 铺平； 1 并且 phosphorylated AMPKα ；当 SREBP1 和 phosphorylated SREBP1 的表示水平显著地在与第一次表明的 liraglutide.ConclusionsThis 学习跟随处理的泡沫房间被减少时， 1 显著地被增加减少氧化应力和丰满的退化在里面上的 liraglutide 的效果导致oxLDL 的 Raw264.7 房间被 AMPK/SREBP1 小径的改变伴随。这研究在减少氧化应力和丰满的退化上为 liraglutide 的效果提供了潜在的分子的机制。

关键词：胰高血糖素样肽-1 氧化低密度脂蛋白泡沫细胞氧化应激 AMPK 信号通路 RAW264.7细胞变性

双功能的工程化单核细胞用于治疗动脉粥样硬化不稳定斑块的研究

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双功能的工程化单核细胞用于治疗动脉粥样硬化不稳定斑块的研究

作者：夏青重庆理工大学

学位级别：硕士

背景:动脉粥样硬化(AS)斑块是导致血管闭塞、动脉血栓形成和急性心血管事件发生的原因,具有高死亡率和发病率。不稳定斑块的形成包括大量单核-巨噬细胞或T细胞浸润、内皮功能障碍、斑块表面纤维帽受损等原因,而其破裂是斑块内部的组织... 详细信息

背景:动脉粥样硬化(AS)斑块是导致血管闭塞、动脉血栓形成和急性心血管事件发生的原因,具有高死亡率和发病率。不稳定斑块的形成包括大量单核-巨噬细胞或T细胞浸润、内皮功能障碍、斑块表面纤维帽受损等原因,而其破裂是斑块内部的组织学特征及炎性微环境下多种因素共同作用的结果。众所周知,炎性反应是贯穿动脉粥样斑块病理进程的关键性因素,在AS斑块形成早期大量炎性细胞浸润,并伴随有泡沫细胞形成。泡沫细胞是形成斑块的前体细胞,由于炎性环境下脂质的摄取和胆固醇反向转运失衡,巨噬细胞对ox-LDL的摄取不受限制,这种不良吞噬严重威胁着胞内脂质代谢稳态。因此,构建一种双功能工程化单核细胞AS斑块精准治疗体系,针对斑块微环境实现不良吞噬抑制和炎性反应调控同步进行,对于降低斑块的破裂风险具有重要意义。目的:设计一种动态吞噬抑制激活的双功能工程化单核细胞治疗系统,针对斑块中炎性反应调控与不良吞噬抑制同步进行,显著提高工程化单核细胞对斑块微环境的治疗效果。拟利用CD47p修饰GQDs-mi RNA223,通过“Don’t eat me”策略实现与单核细胞结合,构建全新的Monocyte-CD47p-GQDs-mi RNA223双功能工程化单核细胞治疗系统。单核细胞在体转运过程中的动态吞噬抑制激活后,可实现“边抑制”、“边调控”。通过本课题的研究,将有望为AS不稳定斑块的精准防治提供全新思路。方法:化学交联法合成CD47p-GQDs-mi RNA223基因体系,随后通过“Don’t eat me”策略实现该体系与RAW264.7细胞的结合,从而构建工程化单核细胞治疗系统M-CD47p-GQDs-mi RNA223,并通过Transwell细胞归巢实验、细胞摄取实验、流式细胞术、ELISA等对工程化细胞的基本理化性质及功能进行研究。通过右颈总动脉(RCCA)结扎手术及高脂饮食喂养的方式构建Apoe小鼠颈动脉斑块模型,分别尾静脉注射生理盐水,Monocyte,CD47p-GQDs-mi RNA223,M-CD47p-GQDs-mi RNA223对各组模型小鼠进行为期四周的治疗,期间观察记录小鼠生长状况。治疗周期结束后,取小鼠血清、颈动脉组织及脏器组织对各治疗组进行药效学评价。结论:成功制备出工程化单核细胞治疗系统M-CD47p-GQDs-mi RNA223,该治疗系统具备向病灶处趋化迁移的生物力学特性。CD47p-SIRPα为动态结合,其有效结合理论时长超过24 h且无需触发即可完成自动脱落,36 h时CD47p-SIRPα的结合逐渐失效,掉落的CD47p-GQDs-mi RNA223自我摄取或被血管常驻巨噬细胞摄取,其调控治疗均是有效的。同时,双功能工程化单核细胞可实现对ox-LDL的边抑制边调控作用。此外,动物实验表明,该治疗体系具有优异的体内安全性及生物相容性,可显著降低AS小鼠血清中高血脂症因子、炎症因子及促AS相关因子,调控AS斑块部位炎性细胞表型,提高颈动脉管腔畅通率,抑制斑块中内源性单核细胞的持续浸润,有望为临床疾病的治疗提供新思路。

关键词：动脉粥样硬化斑块单核细胞双功能泡沫细胞动态吞噬抑制激活

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柚皮素增加自噬抑制泡沫细胞的形成

天然产物研究与开发 2020年第11期32卷 1913-1919页

作者：陈雨露杜延飞郑文武李光郑舒展西南医科大学附属医院心血管内科西南医科大学心血管研究所泸州646000

观察柚皮素(naringenin)对THP-1源性泡沫细胞自噬的影响,初步探讨其防治动脉粥样硬化的可能作用机制。首先使用cck8实验检测不同浓度柚皮素对细胞活性的影响。再将不同浓度的柚皮素(0、10、25、50、100μmol/L)作用于泡沫细胞,Western b... 详细信息

观察柚皮素(naringenin)对THP-1源性泡沫细胞自噬的影响,初步探讨其防治动脉粥样硬化的可能作用机制。首先使用cck8实验检测不同浓度柚皮素对细胞活性的影响。再将不同浓度的柚皮素(0、10、25、50、100μmol/L)作用于泡沫细胞,Western blot检测泡沫细胞中LC3、p62的表达并检测泡沫细胞的总胆固醇含量。然后将柚皮素与雷帕霉素(rapamycin)、3MA分别作用于泡沫细胞后分析LC3、p62的蛋白表达水平。再将柚皮素、compound C分别处理泡沫细胞检测LC3、p-AMPK、AMPK的蛋白表达水平并检测泡沫细胞的总胆固醇(TC)的含量。结果显示,柚皮素对泡沫细胞活性无毒性影响(P>0.05);与模型组相比,柚皮素组LC3II/LC3I比值增加,p62表达减少,总胆固醇含量减少(P泡沫细胞的自噬能力,减轻细胞内胆固醇的含量从而抑制泡沫细胞的形成;柚皮素通过增加AMPK的磷酸化水平促进泡沫细胞的自噬能力,这可能是柚皮素防治动脉粥样硬化的分子机制之一。

关键词：柚皮素泡沫细胞 ox-LDL 自噬动脉粥样硬化

艳山姜挥发油通过调控巨噬细胞CD36和ABCA1表达抑制泡沫细胞的形成

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中国实验方剂学杂志 2020年第4期26卷 64-69页

作者：甘诗泉王声全张光琼安红润付凌云肖潮达陈妍陶玲沈祥春贵州医科大学药学院天然资源有效利用重点实验室贵阳550025

目的:观察艳山姜挥发油对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞的抑制作用,并探索其机制。方法:使用佛波酯(PMA,100μg·L^-1)诱导人白血病单核细胞(THP-1)24 h后形成巨噬细胞,实验分为4组,分别为空白组(无血清RPMI 164... 详细信息

目的:观察艳山姜挥发油对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞的抑制作用,并探索其机制。方法:使用佛波酯(PMA,100μg·L^-1)诱导人白血病单核细胞(THP-1)24 h后形成巨噬细胞,实验分为4组,分别为空白组(无血清RPMI 1640),模型组(80 mg·L^-1ox-LDL),艳山姜挥发油低剂量组(80 mg·L^-1ox-LDL+4μg·L^-1艳山姜挥发油),艳山姜挥发油高剂量组(80 g·L^-1ox-LDL+20μg·L^-1艳山姜挥发油)。噻唑蓝(MTT)比色法检测艳山姜挥发油对巨噬细胞的活性的影响,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测巨噬细胞中白细胞分化抗原36(CD36)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测巨噬细胞内胆固醇酯含量,油红O染色法检测巨噬细胞中脂质小滴的含量。结果:艳山姜挥发油对巨噬细胞无毒性。与空白组比较,模型组的巨噬细胞内脂滴和胆固醇酯的含量显著增加(P细胞中脂滴和胆固醇酯的含量(P细胞向泡沫细胞的转化。结论:艳山姜挥发油对ox-LDL诱导的巨噬细胞向泡沫细胞的形成具有抑制作用,该药理作用与艳山姜挥发油下调巨噬细胞CD36和上调ABCA1蛋白的表达有关。

关键词：艳山姜挥发油巨噬细胞泡沫细胞 THP-1细胞白细胞分化抗原36(CD36) 三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1) 动脉粥样硬化

CIRBP-ABCA1/G1调控轴缺陷加剧化疗药物诱导的泡沫细胞形成

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CIRBP-ABCA1/G1调控轴缺陷加剧化疗药物诱导的泡沫细胞形成

作者：马潇菡郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的化学药物治疗所产生的心血管毒性副作用严重制约肿瘤治疗效果,已成为影响肿瘤患者生存质量和生存率的高危风险因素。其中,化疗相关动脉粥样硬化是化疗所致心血管毒性的重要病理基础之一。泡沫细胞形成在动脉粥样硬化病变早期... 详细信息

背景与目的化学药物治疗所产生的心血管毒性副作用严重制约肿瘤治疗效果,已成为影响肿瘤患者生存质量和生存率的高危风险因素。其中,化疗相关动脉粥样硬化是化疗所致心血管毒性的重要病理基础之一。泡沫细胞形成在动脉粥样硬化病变早期扮演重要角色,脂质代谢紊乱导致的胞内脂质蓄积是造成巨噬细胞向泡沫细胞转变的重要原因。冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)作为一种重要的应激反应蛋白,既能在不同应激刺激下发挥细胞保护作用,又能参与到细胞代谢稳态的维持,然而其是否参与化疗相关巨噬细胞泡沫化以及动脉粥样硬化过程尚未可知。本研究旨在探讨CIRBP在化疗促泡沫细胞形成以及动脉粥样硬化发展中的调控作用及意义,以期为临床化疗相关血管事件的预防和诊治提供新的靶点和思路。研究方法1)ApoE小鼠尾静脉注射阿霉素建立化疗小鼠模型,高脂喂养8-10周后,采用油红O染色评估主动脉根部及全长斑块形成情况,采用免疫荧光分析主动脉根部巨噬细胞数量及分布情况;2)阿霉素、顺铂、环磷酰胺三种常规化疗药物刺激小鼠单核-巨噬细胞系(RAW264.7)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM),氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导24小时建立泡沫细胞模型,采用细胞油红O染色和酶学检测方法评估巨噬细胞脂质蓄积情况,Western blot检测细胞CIRBP蛋白表达;3)慢病毒系统获得稳定沉默CIRBP表达的RAW264.7、CIRBP-/-小鼠的骨髓经巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导获取CIRBP表达缺陷的BMDM,oxLDL刺激24小时后,采用油红O染色和细胞酶学方法检测胞内脂质蓄积情况;4)Western blot检测沉默或敲除CIRBP的RAW264.7或BMDM中脂质摄取(CD36、SR-A、LOX-1)、胆固醇外排(ABCA1、ABCG1、SR-B1)相关蛋白表达情况;Real-time qPCR、mRNA半衰期检测、RNA pull-down、RNA免疫共沉淀(RIP)等技术探讨CIRBP对脂质代谢相关基因的具体调控机制;5)构建ABCA1、ABCG1的过表达质粒,转染至稳定沉默CIRBP的RAW264.7中,oxLDL刺激24小时后,采用油红O染色、细胞酶学检测用于评估ABCA1/G1过表达前、后,胞内脂质蓄积情况。结果1.阿霉素化疗刺激小鼠主动脉根部及全长斑块数量增多、面积增大,主动脉根部斑块部位巨噬细胞数量增多;2.阿霉素、顺铂、环磷酰胺刺激RAW264.7和BMDM胞内脂质蓄积增多,与此同时细胞CIRBP蛋白表达水平下降;3.在沉默或敲除CIRBP的RAW264.7或BMDM中,观察到胞内脂质蓄积增多,泡沫化程度加剧;4.在沉默CIRBP的RAW264.7中,ABCA1/G1蛋白和mRNA表达水平均降低,而CD36、SR-A、LOX-1、SR-B1等脂质受体、转运体表达不变;mRNA半衰期检测证明沉默CIRBP降低了ABCA1/G1 mRNA的稳定性,RIP和RNA pull-down实验证明CIRBP可结合ABCA1/G1的3’非翻译区(3’UTR)进而稳定其mRNA;5.在沉默CIRBP的RAW264.7中过表达ABCA1/G1可减少胞内脂质蓄积,缓解其泡沫化进程。结论:化疗药物造成的CIRBP缺乏可抑制ABCA1和ABCG1表达,阻断巨噬细胞胆固醇外流,加剧泡沫细胞形成,进而加速动脉粥样硬化进程。

关键词：化疗药物血管毒性冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP) 泡沫细胞动脉粥样硬化巨噬细胞胆固醇外排

二氢睾酮通过下调LOX-1的表达抑制J774．1细胞向泡沫细胞转化

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中华医学杂志 2016年第42期96卷 3403-3407页

作者：邱阳胡海地胡冰青陈晓雅徐品一崔磊厉平刘聪李玲中国医科大学附属盛京医院内分泌科沈阳110004 中国医科大学附属第一临床医院血管甲状腺外科

目的探讨雄激素二氢睾酮（DHT）对雌性巨噬细胞系J774．1细胞的植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）表达及泡沫细胞形成的影响。方法体外培养J774．1细胞，通过氧化低密度脂蛋白（OX—LDL）诱导巨噬细胞向泡沫细胞转化，采用1×... 详细信息

目的探讨雄激素二氢睾酮（DHT）对雌性巨噬细胞系J774．1细胞的植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）表达及泡沫细胞形成的影响。方法体外培养J774．1细胞，通过氧化低密度脂蛋白（OX—LDL）诱导巨噬细胞向泡沫细胞转化，采用1×10^-9mol／L和1×10^-8mol／L浓度的DHT进行预处理，提取细胞mRNA及蛋白行实时定量PCR及Western印迹法检测LOX-1mRNA及蛋白表达，油红O染色观察泡沫细胞形态，按照泡沫细胞数／视野及每个视野中油红染色的颗粒面积进行定量分析。结果与对照组（加入乙醇）相比，ox—LDL明显增加J774．1细胞的LOX-1mRNA（4．71±0．31比1．00±0．06）及蛋白（1．75±0．11比1．04±0．04）相对表达水平（均P〈0．01）。应用1×10^-9mol／L和1×10^-9mol／L浓度的DHT可以降低ox-LDL诱导的LOX-1mRNA（2．81±0．46、2．29±0．21比4．71±0．31，均P〈0．05）和蛋白表达水平（1．35±0．06、1．09±0．04比1．75±0．11，均P〈0．05）。这种作用可通过雄激素受体（AR）阻滞剂逆转87．6％（P=0．004）。油红O染色表明ox—LDL明显增加泡沫细胞形成（45．9±3．7比0．0±0．0，P〈0．01）。应用1×10^-9mol／L和1×10^-8mol／L浓度的DHT可以抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成（泡沫细胞数／视野定量分析：36．0±3．0、29．1±1．3比45．9±3．7，均P〈0．05；油红O相对染色面积定量分析：7983±1035、4060±390比14750±2489，均P〈0．05）。结论1×10^-9mol／L和1×10^-8mol／L浓度的DHT通过AR可以减少雌性巨噬细胞系J774．1细胞的LOX-1表达，并抑制J774．1细胞向泡沫细胞转化。

关键词：双氢睾酮雌性巨噬细胞 LDL受体相关蛋白质类泡沫细胞动脉粥样硬化

4-PBA对巨噬细胞来源的泡沫细胞形成的影响

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4-PBA对巨噬细胞来源的泡沫细胞形成的影响

作者：王明昊承德医学院

学位级别：硕士

目的:探究内质网应激抑制剂4-PBA对巨噬细胞来源的泡沫细胞脂质积累及炎症反应的影响,并探究其可能的发生机制。方法:1.油红O染色检测RAW264.7细胞脂质吞噬情况,胆固醇酶法检测细胞胆固醇含量,明确泡沫细胞是否形成;2.CCK8法检测内质网... 详细信息

目的:探究内质网应激抑制剂4-PBA对巨噬细胞来源的泡沫细胞脂质积累及炎症反应的影响,并探究其可能的发生机制。方法:1.油红O染色检测RAW264.7细胞脂质吞噬情况,胆固醇酶法检测细胞胆固醇含量,明确泡沫细胞是否形成;2.CCK8法检测内质网应激抑制剂4-PBA对细胞的活力的影响,摸索出使细胞活力在80%以上的最佳药物浓度;3.实时定量PCR(RT-q PCR)及蛋白质免疫印迹法(Western Blot)法检测脂质流入及流出受体CD36、SR-A、LOX-1、ABCG1的表达情况及内质网应激相关蛋白PERK、IRE1α、GRP78的表达情况;4.ELSA检测炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的浓度。结果:1.100ug/ml ox-LDL处理Raw264.7细胞24小时后,油红O染色显示细胞油红着色增多,提示泡沫细胞形成;2.不同浓度4-PBA处理RAW264.7后,CCK8结果提示使细胞活力在80%以上的最大浓度是3m M;3.100ug/ml ox-LDL处理Raw264.7细胞24小时后与对照组相比PERK、IRE1的m RNA及蛋白表达上调,ATF6表达无明显变化,3m M4-PBA+100ug/ml ox LDL处理Raw264.7细胞24小时后与对照组相比PERK、IRE1的m RNA及蛋白表达下调,ATF6表达无明显变化;4.100ug/ml ox-LDL处理Raw264.7细胞24小时后与对照组相比CD36、SR-A1、LOX-1的m RNA及蛋白表达上调,ABCG1的m RNA及蛋白表达下调;3m M4-PBA+100ug/ml ox-LDL共同处理Raw264.7细胞24小时后与对照组相比CD36、SR-A1、LOX-1m RNA及蛋白表达下调,ABCG1的m RNA及蛋白表达上调;5.100ug/ml ox-LDL处理Raw264.7细胞24小时后与对照组相比IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度升高,3m M4-PBA+100ug/ml ox LDL处理Raw264.7细胞24小时后与对照组相比IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度下降,差异有统计学意义(P细胞向泡沫细胞转换,其形成过程存在内质网应激及炎症反应;2.4-PBA通过抑制CD36、SR-A1、LOX-1的表达,促进ABCG1的表达抑制泡沫细胞形成及炎症反应,其可能机制是通过抑制内质网应激相关蛋白PERK、IRE1相关通路介导的

关键词： 4-PBA 泡沫细胞内质网应激炎症反应

分泌型磷脂酶A2的表达、纯化及对泡沫细胞胆固醇含量的影响

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分泌型磷脂酶A2的表达、纯化及对泡沫细胞胆固醇含量的影响

作者：陈春婷山西医科大学

学位级别：硕士

目的:人源分泌型磷脂酶A2(Human secreted phospholipase A2 GIIE,sPLA2-hGIIE)的表达、纯化,外源性添加sPLA2-hGIIE对泡沫细胞内胆固醇含量的影响。利用毕赤酵母重组表达系统表达人源sPLA2(Human secreted phospholipase A2GIB,sPLA2-hGIB)和其酶原(sPLA2-Pro-hGIB),并采用层析法纯化蛋白。方法:利用毕赤酵母表达系统表达纯化sPLA2-hGIIE、sPLA2-hGIB,采用离子交换和分子排阻两步法纯化蛋白;构建巨噬细胞源性泡沫细胞模型;设计实验组和对照组,采用胆固醇测定试剂盒检测外源添加sPLA2-hGIIE蛋白对泡沫细胞内胆固醇含量的影响;利用荧光定量PCR法分析与泡沫细胞形成相关基因m RNA的表达情况。本研究分为sPLA2-hGIIE的表达纯化,泡沫细胞模型的构建,sPLA2-hGIIE对泡沫细胞胆固醇含量的影响,sPLA2-hGIB表达载体的构建、sPLA2-hGIB蛋白的表达纯化。(1)sPLA2-hGIIE的表达和纯化首先复苏冻存的菌株X33-sPLA2-hGIIE,并在固体平板上划线分离;采用BSM培养基进行放大培养;高速离心收集发酵上清液,并对其进行过滤、浓缩和稀释处理;采用阳离子交换法对样品进行初步纯化,用分子筛进行精细纯化;利用BSA法检测目的蛋白浓度,采用酶活检测试剂盒测定目的蛋白的酶活性。(2)泡沫细胞模型的构建采用不同浓度梯度的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)处理巨噬细胞,CCK-8试剂盒检测其对巨噬细胞存活率的影响;采用ox-LDL处理巨噬细胞不同时间周期(24h、36h、48h),油红O染色法分析细胞内的脂质含量和分布情况。(3)sPLA2-hGIIE对泡沫细胞胆固醇含量的影响使用不同浓度梯度的sPLA2-hGIIE处理巨噬细胞源性泡沫细胞,利用总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(Free cholesterol,FC)试剂盒检测细胞内胆固醇含量;再用油红O染色评估sPLA2-hGIIE抑制泡沫细胞形成的程度;最后用实时荧光定量PCR检测与胆固醇合成、酯化、水解和巨噬细胞脂质流入、流出相关基因的m RNA表达情况。(4)sPLA2-hGIB表达载体的构建根据sPLA2-hGIB核酸蛋白序列设计引物,采用聚合酶链式反应扩增目的基因,用质粒提取试剂盒提取质粒pGAPZαA,双酶切后将目的基因与质粒连接以构建重组载体。并用菌落PCR鉴定、测序验证,再转化到大肠杆菌Top10感受态细胞,提取重组质粒,使用线性化内切酶将重组质粒线性化后电转入酵母细胞X33。将电转后的菌液涂布于YPD固体培养基上。(5)sPLA2-hGIB蛋白的表达纯化筛选并挑取阳性单克隆菌,分别利用YPD和BSM培养基扩大培养,高速离心收集上清液,并对其进行过滤、浓缩和稀释处理,用离子交换层析进行初步纯化,再用分子排阻层析进行精细纯化,利用BSA检测目的蛋白的浓度,最后用酶活试剂盒检测目的蛋白的酶活性。结果:1.CCK-8结果显示80mg/L ox-LDL对巨噬细胞的存活率无明显毒性作用,油红O染色发现80mg/L ox-LDL处理巨噬细胞24h后能稳定建立泡沫细胞模型。2.与造模组相比,外源性添加sPLA2-hGIIE后,巨噬细胞源性泡沫细胞内的总胆固醇和游离胆固醇都有不同程度的下降,其中添加75mg/m L sPLA2-hGIIE蛋白之后,巨噬细胞内的TC降低至40.9%,FC降低至41.1%。3.实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组中与胆固醇合成相关基因HMGCS、与胆固醇酯化(ACAT-1)和水解(n CEH)的相关基因表达量下降,巨噬细胞表面脂质流入相关基因(CD36,SR-A)和脂质流出相关基因ABCG1表达下降。4.成功构建pGAPZαA-hGIB、pGAPZαA-Pro-hGIB重组载体。5.采用电转法成功构建X33-pGAPZαA-hGIB、X33-pGAPZαA-Pro-hGIB毕赤酵母表达菌种;采用分级培养法扩大培养。6.使用阳离子柱和分子筛两步纯化,获得的sPLA2-Pro-hGIB蛋白浓度为0.233mg/m L,每升培养基能获得0.2mg左右的目的蛋白。sPLA2-hGIB的阳离子柱初步纯化结果显示蛋白浓度过低,因此需要进一步优化sPLA2-hGIB表达方案。结论:成功表达、纯化sPLA2-hGIIE蛋白,构建巨噬细胞源性泡沫细胞,外源性添加sPLA2-hGIIE后能降低细胞内的胆固醇含量。构建pGAPZαA-hGIB、pGAPZαA-Pro-hGIB重组载体,并利用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达。

关键词： sPLA2 sPLA2-hGIIE 泡沫细胞 sPLA2-hGIB sPLA2-Pro-hGIB