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氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

食品研究与开发 2022年第10期43卷 195-201页

作者：高孝高洁刘晓宇王中选刘庆涛桑亚新河北农业大学食品科技学院河北保定071000 安徽工程大学生物与食品工程学院安徽芜湖241000

将合成的来源于长孢洛德酵母菌(Lodderomyces elongisporus)属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力... 详细信息

将合成的来源于长孢洛德酵母菌(Lodderomyces elongisporus)属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86 U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg^(2+)对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu^(2+)以及Fe^(3+)对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数K_(m)值为6.64 mmol/L,最大反应速率V_(max)值为8.24μmol/min。

关键词：氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯水解酶异源表达酶学性质长孢洛德酵母菌

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氨基甲酸乙酯水解酶分子改造及功能表征

氨基甲酸乙酯水解酶分子改造及功能表征

作者：昝其佳江南大学

学位级别：硕士

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是发酵食品生产、运输、贮藏过程中产生的一种微量有毒有害物质,对人体具有潜在的致癌性和遗传毒性。发酵酒精饮料中EC对人体的危害大于其他发酵食品,物理和化学办法难以除去酒中的EC,但EC水解酶水解... 详细信息

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是发酵食品生产、运输、贮藏过程中产生的一种微量有毒有害物质,对人体具有潜在的致癌性和遗传毒性。发酵酒精饮料中EC对人体的危害大于其他发酵食品,物理和化学办法难以除去酒中的EC,但EC水解酶水解条件温和、效率高,是一种可靠且有效的降解方法。但长期以来,EC水解酶由于存在乙醇耐受性、稳定性差的问题而难以在工业中得到应用,因此本研究针对上述问题改造一种来自于赖氨酸芽孢杆菌的EC水解酶,具体研究内容如下:首先,采用双相高压分子动力学模拟(diphasic high pressure molecular dynamic simulation,d HP-MD)对EC水解酶进行改造,筛选得到了阳性单点突变体。研究选择等温压缩系数波动较大的loop区域作为改造的敏感区域,利用Fold X和I-mutant计算敏感区域中突变体的自由能变化,最终得到潜在的稳定性提高的突变体:A321I、S325F、S325Y、S325N、Q332E、Q332G、H68A、H68L、H68M、H68K、H68Y、K70R和A178L。验证上述突变体中酶学性质较好的为H68A、K70R、A178L和S325N,它们的比酶活分别为WT的2.78倍、1.78倍2.84倍、2.21倍。在10%(v/v)乙醇浓度下,H68A、S325N、K70R和A178L的相对酶活相较于WT提高至1.31倍、2.63倍、1.81倍和1.78倍。其次,经验证组合突变使EC水解酶的酶学性质得到提高,并对其乙醇耐受性提高的原因进行了解析。其中乙醇耐受性最好的三点突变体H68A/K70R/S325N的比酶活为WT的3.41倍,其在20%(v/v)浓度乙醇下的相对酶活是WT的5.02倍,T值提升至54.9℃。为分析其乙醇耐受性提高的原因,在1 bar、50%(v/v)浓度乙醇环境中对H68A/K70R/S325N进行模拟,发现突变位点附近形成了新的氢键并且波动减小,蛋白整体结构的乙醇抗性增强。此外,70R、325N和活性中心附近的乙醇分子数相较于突变前都有所减少,这可能也是突变体乙醇耐受性提高的原因。最后,通过固定化EC水解酶进一步提高其酶学性质。经优化后的固定化条件为:利用1%(v/v)浓度的戊二醛活化壳聚糖小球3 h,后与酶液交联4 h。固定化后H68A/K70R/S325N的乙醇耐受性为游离酶的1.85倍,55℃条件下的酶活提高至28.30%。在初步探究EC水解酶的重复利用实验的第五次反应中,固定化小球仍有54.31%的相对酶活。固定化和游离的H68A/K70R/S325N分别在模拟酒样中降解了32.52%和28.62%的EC。综上,研究通过dHP-MD方法有效地获得了酶活和乙醇耐受性提高的突变体H68A/K70R/S325N,并通过固定化进一步探索了其在工业规模上推广应用的潜力,可为后续EC水解酶的改造奠定基础。

关键词：氨基甲酸乙酯水解酶乙醇耐受性双相高压分子动力学模拟酶学性质固定化

假丝酵母氨基甲酸乙酯水解酶的分子克隆及酶学性质

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食品与发酵工业 2022年第3期48卷 56-62页

作者：张献冯治平张耀张雪怡杨丽娟四川轻化工大学生物工程学院四川宜宾644000 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室(四川轻化工大学) 四川宜宾644000

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物。生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯。该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达。实验结果表明,cpUH基因... 详细信息

氨基甲酸乙酯是存在于发酵食品中的一种潜在致癌物。生物酶法可有效降解氨基甲酸乙酯。该研究从假丝酵母CCTCC AY 2017001基因组中克隆了氨基甲酸乙酯水解酶基因cpUH,并实现了其在Escherichia coli中的高效表达。实验结果表明,cpUH基因大小为1656 bp,编码552个氨基酸;重组蛋白大小约为60 kDa,纯化后比酶活力为3.10 U/mg;cpUH的最适反应温度和pH分别为40℃和7.5,其在25~30℃和pH 6.0~9.0均有较好的稳定性;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)明显抑制酶活力,其余Fe^(3+)、Mn^(2+)、Ca^(2+)、Co^(2+)、Mg^(2+)都对酶活力有抑制作用,而EDTA对酶活力无影响;此外,以氨基甲酸乙酯为底物时,其K_(m)和V_(max)值分别为6.01 mmol/L和3.34μmol/min,且cpUH对乙醇具有一定的耐受性,有望应用到酒饮料生产中。

关键词：假丝酵母氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯水解酶异源表达酶学性质

氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

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过程工程学报 2014年第5期14卷 846-852页

作者：吕思熠方芳堵国成陈坚江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122

将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化.结... 详细信息

将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化.结表明,酶活最高可达到14.20 U/mL,产酶最佳培养基成分为:淀粉10 g/L、磷酸氢二钾9 g/L、麦芽浸膏25 g/L、硫酸镁1 g/L、胰蛋白胨55 g/L,最适发酵温度为37℃,最佳接种量4%.在3 L发酵罐中采用最优发酵条件,酶活在16 h达到18.03 U/mL.

关键词：氨基甲酸乙酯水解酶枯草芽孢杆菌培养基发酵响应面

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氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质

食品与生物技术学报 2014年第12期33卷 1239-1245页

作者：李京京方芳张继冉刘龙堵国成陈坚江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全.酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法.从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌.通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵... 详细信息

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全.酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法.从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌.通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶.SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 kDa.该酶最适反应温度为35℃,最适pH值为7.0,在10～45℃时,具有良好的热稳定性.以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1.金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶.此外,该酶对低浓度的NaC1和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力.

关键词：赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯水解酶分离纯化酶学性质

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氨基甲酸乙酯水解酶的筛选及分子改造

氨基甲酸乙酯水解酶的筛选及分子改造

作者：刘晓慧江南大学

学位级别：硕士

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是发酵食品(如酱油、泡菜)和酒精饮料(葡萄酒、黄酒)在生产、储藏过程中生成的对人体具有潜在遗传毒性的一种微量有害物质。氨基甲酸乙酯水解酶(Urethanase,UH)能够降解EC,生成乙醇、二氧化碳和氨,对... 详细信息

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是发酵食品(如酱油、泡菜)和酒精饮料(葡萄酒、黄酒)在生产、储藏过程中生成的对人体具有潜在遗传毒性的一种微量有害物质。氨基甲酸乙酯水解酶(Urethanase,UH)能够降解EC,生成乙醇、二氧化碳和氨,对保障发酵食品安全具有潜在的应用价值。目前已报道的UH对乙醇的耐受性较差,酸性UH的底物特异性和对底物的亲和力较差,因此获得稳定性好和底物亲和力高的酸性UH是实现其工业化应用的重要前提。本研究以获得满足工业应用条件的氨基甲酸乙酯水解酶为研究目标,通过筛选微生物来源的氨基甲酸乙酯水解酶和进行酶学性质比较,选择具有较好应用特性的UH进行分子改造,提高UH耐酸、耐乙醇和底物亲和力等方面的应用特性。主要研究结果是:1.运用高通量筛选技术从高温大曲中分离得到三株有氨基甲酸乙酯水解酶活性的细菌,其中一株腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus L1)的氨基甲酸乙酯水解酶粗酶有较好的耐乙醇特性。经过硫酸铵分级沉淀、离子层析、疏水层析和凝胶过滤等多步纯化得到了降解EC的纯酶,通过比较发现纯酶对乙醇的耐受性大幅降低。将此酶与来源于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis SC02)的UH进行酶学性质比较,发现来源于腐生葡萄球菌的氨基甲酸乙酯水解酶对乙醇的耐受性低于后者。因此,确定对来源于*** SC02的氨基甲酸乙酯水解酶进行分子改造。2.采用融合双亲短肽策略,在大肠杆菌BL21中表达了6种N端融合双亲短肽的*** UH重组酶SAP1-UH,SAP2-UH,SAP3-UH,SAP4-UH,SAP5-UH和SAP6-UH。通过对重组酶特性分析发现,只有SAP1-UH有活性,其最适反应温度未发生变化,在40℃下的半衰期由3.7 min提高为15.4 min,提高了4.2倍。SAP1-UH最适反应pH值由7.0降为6.5,比酶活提高了93%。3.通过对*** UH三维结构模拟,用分子动力学预测其氨基酸的RMSF值和B-factor值以及用蛋白质折叠自由能变化预测,发现Q328和Q357位点是UH的两个不稳定位点。通过对UH Q328位点进行饱和突变,获得了有UH活性的4个突变体(Q328C、Q328V、Q328R和Q328H)。其中突变体Q328C在40℃下的半衰期比UH提高了7.46倍,对乙醇和酸的耐受性也有所提高。4.为进一步改善*** UH的应用特性,对突变体Q328C的Q357位点进行饱和突变,获得了有活性的UH双突变体Q328C:Q357W。经测定,Q328C:Q357W在高温条件下热稳定性明显优于野生酶,其40°C下的半衰期为89.4 min,是野生酶的23.8倍。同未改造的UH相比,Q328C:Q357W的最适pH降为6.5,在pH为6.0、5.5和5.0下,Q328C:Q357W的相对酶活比UH分别提高30.2%,21.0%和7.0%。对乙醇的耐受性有所提高,在2%、5%和10%的乙醇条件下,相对酶活分别比UH提高29.0%、22.1%和8.5%。Q328C:Q357W的K值也比UH降低2倍。

关键词：氨基甲酸乙酯氨基甲酸乙酯水解酶定点突变双亲短肽

氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

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氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

作者：吕思熠江南大学

学位级别：硕士

氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate, EC),是发酵食品和发酵酿造酒生产过程中自然产生的一种微量有害物质,对人体具有潜在的致癌性和遗传毒性。运用生物酶法去除食品中的EC是一种直接、高效的手段。氨基甲酸乙酯水解酶能将EC分解为无害的乙醇... 详细信息

氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate, EC),是发酵食品和发酵酿造酒生产过程中自然产生的一种微量有害物质,对人体具有潜在的致癌性和遗传毒性。运用生物酶法去除食品中的EC是一种直接、高效的手段。氨基甲酸乙酯水解酶能将EC分解为无害的乙醇、氨及二氧化碳,在保障发酵食品安全方面具有广阔的应用前景。本研究对氨基甲酸乙酯水解酶进行了异源表达和产酶发酵优化,主要研究结果如下：(1)将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(Urethanase, UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行了克隆Bacillus subtilis WB600/pMA5-uh),实现了UH活性表达。在此基础上,尝试了将UH基因在枯草芽孢杆菌及乳酸乳球菌中分泌表达。(2)在摇瓶水平上通过单因素实验对重组菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-uh发酵培养基成分和发酵条件进行优化,确定发酵最优碳源(淀粉)、最优氮源组合(胰蛋白胨、麦芽浸膏)、最优金属离子(Mg2+)、最适发酵温度(37℃)、最佳接种量(4%),在此发酵条件下酶活最高可达到7.20 U-mL-1。(3)在单因素优化的基础上,通过响应面分析对发酵培养基进行了优化。采用Placket-Burman法确定了胰蛋白胨和磷酸氢二钾为影响产酶水平的关键因素。最终确定产酶最佳培养基为：淀粉10 g.L-1、蛋白胨55 g.L-1、麦芽浸膏25 g.L-1、磷酸氢二钾9g.L-1、硫酸镁10 mmol·L-1。在3L发酵罐验证最优发酵条件,氨基甲酸乙酯水解酶产量达18.03 U·mL-1,比优化前产量提高了17倍。(4)通过添加稳定剂的方式对UH在乙醇和酸性条件下的稳定性进行了改善。考察了11种稳定剂对酶的保护作用,筛选甘油、葡萄糖、蔗糖最为稳定剂。通过正交实验确定复合稳定剂中各组分的浓度,最佳稳定剂组合：甘油80 g.L-1、葡萄糖3 g.L-1、蔗糖1 g.L-1。添加复合稳定剂后酶的耐乙醇能力、pH稳定性均有明显提高。

关键词：氨基甲酸乙酯水解酶氨基甲酸乙酯发酵优化枯草芽孢杆菌

赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯水解酶的发酵条件优化

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食品与生物技术学报 2017年第3期36卷 259-265页

作者：王伟高陈坚周景文江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122

氨基甲酸乙酯是发酵酒精饮料及发酵食品中一种广泛存在的致癌物,酶法降解是解决氨基甲酸乙酯污染的重要途径之一。作者以一株来源于小鼠胃部具有水解氨基甲酸乙酯活性的菌株Lysinibacillus fusiformis SC02为出发菌株,通过摇瓶水平单因... 详细信息

氨基甲酸乙酯是发酵酒精饮料及发酵食品中一种广泛存在的致癌物,酶法降解是解决氨基甲酸乙酯污染的重要途径之一。作者以一株来源于小鼠胃部具有水解氨基甲酸乙酯活性的菌株Lysinibacillus fusiformis SC02为出发菌株,通过摇瓶水平单因素实验对其产酶条件进行了优化。优化后的培养基组成为:半乳糖25 g/L,大豆蛋白胨20 g/L,尿素4 g/L,硫酸铜0.02 g/L,pH6.0。最佳产酶的发酵条件为:发酵温度37℃,接种体积分数3%,装液量20 m L/250 m L。在上述优化的培养基和培养条件下,产酶水平由900 U/L提高到4 500 U/L,提高了350%。在3 L发酵罐水平上初步探究了不同搅拌转速对菌株产酶的影响。当搅拌转速达到800 r/min,菌株最高酶活水平由4 500 U/L提高到7 066 U/L,提高了57%。

关键词：氨基甲酸乙酯水解酶发酵条件优化芽孢杆菌发酵食品

定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性

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生物工程学报 2016年第9期32卷 1233-1242页

作者：刘晓慧方芳夏小乐堵国成陈坚江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 食品安全与营养协同创新中心江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的氨基甲酸乙酯水解... 详细信息

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种存在于发酵食品和酿造酒精饮料中的潜在致癌物质。利用生物酶法去除食品饮料中的EC是一种较为安全有效的方法。本研究以来源于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的氨基甲酸乙酯水解酶为研究对象,采用计算机辅助设计突变位点,构建了其不稳定区域Q328位点的饱和突变体。通过酶学性质分析发现,突变体Q328C和Q328V在40℃下的半衰期分别提高了7.46和1.99倍,Q328R在高温下也有比原酶更好的耐受性。此外,突变体Q328C对乙醇的耐受性和酸耐受性也有所提高。对氨基甲酸乙酯水解酶分子改造的结果表明,通过改造其不稳定区域Q328位点,可以提高酶的热稳定性及对酸和乙醇的耐受性。

关键词：定点突变氨基甲酸乙酯水解酶氨基甲酸乙酯酶稳定性