氨基甲酸乙酯水解酶的筛选及分子改造

作     者：刘晓慧 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：方芳

授予年度：2016年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 定点突变 双亲短肽 

摘      要：氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是发酵食品(如酱油、泡菜)和酒精饮料(葡萄酒、黄酒)在生产、储藏过程中生成的对人体具有潜在遗传毒性的一种微量有害物质。氨基甲酸乙酯水解酶(Urethanase,UH)能够降解EC,生成乙醇、二氧化碳和氨,对保障发酵食品安全具有潜在的应用价值。目前已报道的UH对乙醇的耐受性较差,酸性UH的底物特异性和对底物的亲和力较差,因此获得稳定性好和底物亲和力高的酸性UH是实现其工业化应用的重要前提。本研究以获得满足工业应用条件的氨基甲酸乙酯水解酶为研究目标,通过筛选微生物来源的氨基甲酸乙酯水解酶和进行酶学性质比较,选择具有较好应用特性的UH进行分子改造,提高UH耐酸、耐乙醇和底物亲和力等方面的应用特性。主要研究结果是:1.运用高通量筛选技术从高温大曲中分离得到三株有氨基甲酸乙酯水解酶活性的细菌,其中一株腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus L1)的氨基甲酸乙酯水解酶粗酶有较好的耐乙醇特性。经过硫酸铵分级沉淀、离子层析、疏水层析和凝胶过滤等多步纯化得到了降解EC的纯酶,通过比较发现纯酶对乙醇的耐受性大幅降低。将此酶与来源于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis SC02)的UH进行酶学性质比较,发现来源于腐生葡萄球菌的氨基甲酸乙酯水解酶对乙醇的耐受性低于后者。因此,确定对来源于*** SC02的氨基甲酸乙酯水解酶进行分子改造。2.采用融合双亲短肽策略,在大肠杆菌BL21中表达了6种N端融合双亲短肽的*** UH重组酶SAP1-UH,SAP2-UH,SAP3-UH,SAP4-UH,SAP5-UH和SAP6-UH。通过对重组酶特性分析发现,只有SAP1-UH有活性,其最适反应温度未发生变化,在40℃下的半衰期由3.7 min提高为15.4 min,提高了4.2倍。SAP1-UH最适反应pH值由7.0降为6.5,比酶活提高了93%。3.通过对*** UH三维结构模拟,用分子动力学预测其氨基酸的RMSF值和B-factor值以及用蛋白质折叠自由能变化预测,发现Q328和Q357位点是UH的两个不稳定位点。通过对UH Q328位点进行饱和突变,获得了有UH活性的4个突变体(Q328C、Q328V、Q328R和Q328H)。其中突变体Q328C在40℃下的半衰期比UH提高了7.46倍,对乙醇和酸的耐受性也有所提高。4.为进一步改善*** UH的应用特性,对突变体Q328C的Q357位点进行饱和突变,获得了有活性的UH双突变体Q328C:Q357W。经测定,Q328C:Q357W在高温条件下热稳定性明显优于野生酶,其40°C下的半衰期为89.4 min,是野生酶的23.8倍。同未改造的UH相比,Q328C:Q357W的最适pH降为6.5,在pH为6.0、5.5和5.0下,Q328C:Q357W的相对酶活比UH分别提高30.2%,21.0%和7.0%。对乙醇的耐受性有所提高,在2%、5%和10%的乙醇条件下,相对酶活分别比UH提高29.0%、22.1%和8.5%。Q328C:Q357W的K值也比UH降低2倍。