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Npas4在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用及其可能机制

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中国病理生理杂志 2021年第8期37卷 1409-1414页

作者：石子璇饶维姬广辉腰向颖解放军总医院第六医学中心中医内科北京100048 解放军总医院第六医学中心神经外科北京100048

目的:探讨神经元PAS结构域蛋白4(Npas4)在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤中的作用及其可能机制。方法:建立小鼠原代培养的皮层神经元OGD/R损伤模型,检测OGD/R损伤后Npas4及突触后膜骨架蛋白Homer1a的mRNA和蛋白表达水平;... 详细信息

目的:探讨神经元PAS结构域蛋白4(Npas4)在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤中的作用及其可能机制。方法:建立小鼠原代培养的皮层神经元OGD/R损伤模型,检测OGD/R损伤后Npas4及突触后膜骨架蛋白Homer1a的mRNA和蛋白表达水平;实验分为对照组、OGD/R组、无关序列(scramble)+OGD/R组和Npas4短发夹RNA(Npas4-shRNA)+OGD/R组,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞的损伤程度,采用Westernblot法检测各组细胞Bax、Bcl-2、cleavedcaspase-3及Homer1a的蛋白表达水平。结果:与对照组比较,OGD/R损伤早期Npas4及Homer1a的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);转染Npas4-shRNA可显著逆转OGD/R引起的Npas4蛋白水平上调;与scramble+OGD/R组相比,下调Npas4进一步加重OGD/R所致神经元活力降低、LDH释放及细胞凋亡(P<0.05),且神经保护分子Homer1a的蛋白表达水平也显著降低(P<0.05)。结论:Npas4可减轻小鼠原代培养的皮层神经元OGD/R损伤,且可能是通过上调神经保护分子Homer1a的表达发挥部分保护作用。

关键词：神经元PAS结构域蛋白4 氧糖剥夺/复氧神经元 Homer1a蛋白细胞凋亡

髓样细胞激活受体2调控氧糖剥夺/复氧模型小鼠小胶质细胞向M2型极化

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解剖学报 2021年第3期52卷 329-336页

作者：胥虹贝罗勇重庆医科大学附属医院神经内科重庆400016 贵州医科大学附属医院神经内科贵阳550004

目的探讨TREM2调控氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型小鼠小胶质细胞向M2型极化的机制。方法体外培养N9小胶质细胞系,采用TREM2过表达慢病毒(LV-TREM2)转染N9细胞,空载病毒LV-scramble作为对照组,并建立OGD/R模型。将OGD/R细胞随机分为OGD/R组、... 详细信息

目的探讨TREM2调控氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型小鼠小胶质细胞向M2型极化的机制。方法体外培养N9小胶质细胞系,采用TREM2过表达慢病毒(LV-TREM2)转染N9细胞,空载病毒LV-scramble作为对照组,并建立OGD/R模型。将OGD/R细胞随机分为OGD/R组、OGD/R+LV-scramble组和OGD/R+LV-TREM2组。Real-time PCR检测TREM2 mRNA在OGD/R组细胞复氧72 h内表达情况。免疫荧光染色观察慢病毒LV-scramble和LV-TREM2在正常N9小胶质细胞内转染情况,Real-time PCR和Western blotting验证慢病毒转染效率,Real-time PCR和ELISA检测小胶质细胞M1型标志物肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和诱生型一氧化氮合酶(i NOS)及M2型标志物精氨酸酶1(Arg-1)和IL-10 mRNA和蛋白表达情况。Western blotting检测磷酸化-磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-ⅠκBα)和ⅠκBα蛋白含量,免疫荧光分析核因子κB P65(NF-κB P65)蛋白在细胞内分布情况。结果复氧72 h内,OGD/R组细胞TREM-2 mRNA含量明显增加,高峰位于24 h和48 h;慢病毒LV-TREM2可有效促进OGD/R组细胞TREM2 mRNA和蛋白表达(P<0.001,P<0.01)。与OGD/R组相比,OGD/R+LV-TREM2组TNF-α、IL-1β和i NOS mRNA和蛋白明显降低,而Arg-1和IL-10 mRNA和蛋白含量明显升高(P<0.05);此外,OGD/R+LV-TREM-2组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05),p-ⅠκBα/ⅠκBα比值显著下降(P<0.001),且NF-κB P65蛋白核转位明显被削弱。结论TREM-2过表达可促进OGD/R模型小胶质细胞向M2型转化从而发挥抗炎作用,该作用与TREM-2调控小胶质细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路有关。

关键词：氧糖剥夺/复氧髓样细胞激活受体2 磷脂酰肌醇-3激酶蛋白激酶B 核因子κB 免疫印迹法小胶质细胞

M1型小胶质细胞源性外泌体携载miR-20a-5p对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响

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中华危重病急救医学 2022年第8期34卷 842-847页

作者：刘文洁尹雪云王红陈静燕单凯悦陈怀龙张高峰王明山董瑞青岛大学附属青岛市市立医院麻醉科山东青岛266071 青岛大学附属青岛市妇女儿童医院教育培训科山东青岛266034 南京医科大学青岛临床医学院山东青岛266071

目的探讨M1型小胶质细胞源性外泌体(M1-exo)对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响,并研究其作用机制。方法取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2,加入100μg/L脂多糖(LPS)和20μg/Lγ-干扰素(IFN-γ)诱导小胶质细胞极化为M1表型,通过蛋白质免... 详细信息

目的探讨M1型小胶质细胞源性外泌体(M1-exo)对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响,并研究其作用机制。方法取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2,加入100μg/L脂多糖(LPS)和20μg/Lγ-干扰素(IFN-γ)诱导小胶质细胞极化为M1表型,通过蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、免疫荧光法鉴定M1型小胶质细胞。收取M1型小胶质细胞的上清液,用ExoQuick-TCTM试剂盒提取M1-exo,通过透射电镜及纳米颗粒粒径分析(NTA)观察外泌体形态,采用Western blotting法检测外泌体标记蛋白白细胞分化抗原(CD9、CD63)的表达。将生长良好的小鼠神经母细胞瘤细胞N2a分为6组:C组细胞常规培养;O组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺/复氧损伤模型;E组的N2a细胞氧糖剥夺3 h后复糖复氧并与M1-exo共培养24 h;NC组、M组和I组分别构建阴性对照、过表达和敲低微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)的M1-exo,通过qPCR检测转染是否成功。NC组、M组和I组N2a细胞氧糖剥夺3 h后,与转染后的M1-exo共培养24 h后检测各项指标。采用细胞增殖检测试剂(CCK-8)法检测细胞活力,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用qPCR法检测miR-20a-5p表达。结果与M0型小胶质细胞相比,M1型小胶质细胞特异性标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)荧光强度及其mRNA和蛋白表达均明显升高〔CD32(荧光强度):36.919±1.541比3.533±0.351,CD32 mRNA(2^(-ΔΔCt)):4.887±0.031比1.003±0.012,CD32/β-actin:2.663±0.219比1.000±0.028;iNOS(荧光强度):29.513±1.197比7.933±0.378,iNOS mRNA(2^(-ΔΔCt)):4.829±0.177比1.000±0.016,iNOS/β-actin:1.991±0.035比1.000±0.045;均P氧糖剥夺/复氧后N2a细胞的损伤。与E组比较,M组N2a细胞活力明显下降,细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显升高〔细胞活力(A值):0.311±0.028比0.412±0.029,细胞凋亡率:(36.343±0.761)%比(31.802±0.647)%,miR-20a-5p(2^(-ΔΔCt)):32.348±0.348比8.912±0.183,均P氧糖剥夺复氧后神经元的损伤,这一损伤作用可能与其携载的miR-20a-5p有关。

关键词：氧糖剥夺/复氧外泌体实时荧光定量聚合酶链反应 CD63 膜性结构小胶质细胞白细胞分化抗原微小RNA

高迁移率族蛋白B1通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达促进氧糖剥夺/复氧星形胶质细胞的凋亡

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北京大学学报（医学版） 2018年第5期50卷 785-791页

作者：李满李圆孙麟宋君来吕聪山西医科大学第二临床医学院神经内科太原030001 山西医科大学基础医学院太原030001 山西医学科学院山西大医院骨科太原030032

目的:研究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在氧糖剥夺/复氧后对星形胶质细胞凋亡的影响,同时通过检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达变化探讨其可能的作用机制。方法:将体外培养新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞分为正常... 详细信息

目的:研究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)在氧糖剥夺/复氧后对星形胶质细胞凋亡的影响,同时通过检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达变化探讨其可能的作用机制。方法:将体外培养新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞分为正常组、模型组、干扰组、对照组,用携带大鼠HMGB1的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体干扰星形胶质细胞抑制HMGB1表达后进行氧糖剥夺/复氧处理,氧糖剥夺6 h、复氧24 h后检测。通过Western blotting法检测RNA干扰效果,通过MTT细胞存活实验检测细胞损伤,通过TUNEL法检测细胞凋亡,最后通过Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。结果:与正常组比较,模型组经过氧糖剥夺/复氧处理后星形胶质细胞内HMGB1表达明显升高(P氧糖剥夺/复氧后HMGB1的释放可以导致星形胶质细胞损伤及细胞凋亡,其作用机制可能与调控凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达有关。

关键词：星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧 HMGB1蛋白质凋亡细胞培养 RNA干扰

Prdx1基因敲减促进氧糖剥夺/复氧诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡

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中国病理生理杂志 2021年第8期37卷 1422-1429页

作者：王海鹏刘同帅于群张佳文王明山青岛大学附属青岛市市立医院麻醉科山东青岛266071 潍坊医学院麻醉学院山东潍坊261053 南京医科大学青岛临床医学院山东青岛266071

目的:观察过氧化还原蛋白1(Prdx1)基因敲减对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡的作用,并进一步探讨其可能机制。方法:体外培养小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,构建OGD/R诱导的N2a细胞损伤模型。将对数生长期的N2a细胞... 详细信息

目的:观察过氧化还原蛋白1(Prdx1)基因敲减对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡的作用,并进一步探讨其可能机制。方法:体外培养小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,构建OGD/R诱导的N2a细胞损伤模型。将对数生长期的N2a细胞随机分为正常对照组、OGD/R组、OGD/R+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)组、OGD/R+阴性对照序列(siNC)组、OGD/R+siPrdx1组和OGD/R+siPrdx1+SP600125组。用siRNA转染细胞;CCK-8比色法检测细胞活力;TUNEL染色法检测细胞凋亡;RT-qPCR检测Prdx1 mRNA的表达;Westernblot检测Prdx1、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及凋亡执行蛋白cleavedcaspase-3的蛋白水平。结果:体外培养的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞经OGD/R处理后出现明显损伤,表现为细胞活力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增高(P<0.05);此外,Prdx1蛋白表达水平亦增高(P<0.05)。Prdx1基因敲减显著促进了OGD/R诱导的JNK和caspase-3激活(P<0.05),细胞活力显著降低(P<0.05),同时显著加剧细胞凋亡(P<0.05)。SP600125可显著抑制OGD/R诱导的JNK和caspase-3激活(P<0.05),减少细胞凋亡(P<0.05),逆转OGD/R条件下Prdx1基因敲减对N2a细胞的损伤作用。结论:Prdx1基因敲减促进OGD/R诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡,其机制与进一步激活JNK/caspase-3信号通路有关。

关键词：过氧化还原蛋白1 神经母细胞瘤氧糖剥夺/复氧细胞凋亡 JNK/caspase-3信号通路

吡拉格雷钠对氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿及AQP4表达的影响

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中国药理学通报 2015年第12期31卷 1661-1667页

作者：许淑红尹茂山吴玉林中国药科大学药学院江苏南京211198 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院山东济南250200 山东省医学科学院药物研究所山东济南250062

目的探讨氧糖剥夺并复氧培养后星形胶质细胞水肿及其水通道蛋白4(AQP4)表达的变化以及吡拉格雷(TSF)对其表达变化的影响。方法体外培养原代星形胶质细胞,建立氧糖剥夺/复氧细胞水肿模型,并随机分为正常组、氧糖剥夺/复氧损伤(OGD/Reox)... 详细信息

目的探讨氧糖剥夺并复氧培养后星形胶质细胞水肿及其水通道蛋白4(AQP4)表达的变化以及吡拉格雷(TSF)对其表达变化的影响。方法体外培养原代星形胶质细胞,建立氧糖剥夺/复氧细胞水肿模型,并随机分为正常组、氧糖剥夺/复氧损伤(OGD/Reox)组、奥扎格雷钠(Ozagrel)阳性对照组和TSF治疗组,在氧糖剥夺/复氧损伤后6、12、24和48 h 4个时间点测定细胞体积变化,乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、MTT法检测细胞损伤及存活情况,Western blot法检测各组细胞膜AQP4蛋白的表达水平,RT-PCR法检测各组细胞AQP4 m RNA的转录水平。结果星形胶质细胞经缺氧再复氧处理,随着复氧时间的延长细胞损害加重(P氧糖剥夺/复氧后的LDH漏出率较OGD/Reox损伤组明显降低(P氧糖剥夺/复氧相比较MTT检测细胞活力明显升高(P氧糖剥夺/复氧损伤引起的星形胶质细胞水肿,可能是通过降低氧糖剥夺后AQP4的表达水平而实现。

关键词：吡拉格雷钠星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧细胞体积乳酸脱氢酶漏出率细胞水肿水通道蛋白4

红景天苷对人脐静脉内皮细胞氧糖剥夺/复氧损伤的保护作用

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中国药理学通报 2018年第6期34卷 831-836页

作者：苏燕青汪旭雯王颖峥宋百颖林昱黄鑫洪桂祝福建中医药大学药学院福建福州350122 福建中医药大学康复技术工程研究中心福建福州350122

目的探讨红景天苷对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型的影响及其可能机制。方法选取处于对数生长期的HUVEC细胞,分为正常组、OGD/R模型组、Sal给药组,建立OGD/R损伤模型;细胞进行12、16、20 h 3个时间点OGD造模,MTT检测细胞存活率,确定OGD的时间点;细胞培养液LDH活力检测探索最佳给药溶度;细胞培养液NO含量检测确定最佳给药溶度;Annexin V/PI法检测细胞凋亡程度;免疫组化法检测P-selectin表达。结果 MTT检测确定OGD的时间点为16h;细胞培养液LDH活力检测和NO含量检测显示,红景天苷浓度为10μmol·L^(-1)时药效最好;与正常对照组相比,造模后细胞凋亡率、P-selectin的表达明显升高(P<0.01);与OGD/R组相比,给药后细胞凋亡率、P-selectin的表达下降(P<0.05)。结论红景天苷对HUVEC的OGD/R损伤模型具有保护作用,且能降低HUVEC中P-selectin的表达。

关键词：红景天苷炎症反应脑缺血/再灌注氧糖剥夺/复氧人脐静脉内皮细胞 P-selectin

NRG1基因修饰的大鼠BMSCs对体外氧糖剥夺/复氧损伤少突胶质细胞的保护作用

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中国病理生理杂志 2022年第11期38卷 1962-1971页

作者：赵富生陈君杨国宏符禹玄张可心李媛媛武庚牡丹江医学院黑龙江牡丹江157000

目的:探讨神经调节蛋白1(NRG1)基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤少突胶质细胞(CG4细胞)的保护作用及可能机制。方法:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,取第3代BMSCs转染NRG1基因。体外培养CG4细... 详细信息

目的:探讨神经调节蛋白1(NRG1)基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤少突胶质细胞(CG4细胞)的保护作用及可能机制。方法:采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,取第3代BMSCs转染NRG1基因。体外培养CG4细胞,分为常规培养(control)组、OGD/R组、OGD/R处理CG4细胞与BMSCs共培养组(BMSCs组)和OGD/R处理CG4细胞与NRG1-BMSCs共培养组(NRG1-BMSCs组)。采用倒置相差显微镜观察CG4细胞形态学变化;MTT法和细胞划痕实验检测CG4细胞活力和迁移能力;二氢乙啶(DHE)荧光探针检测CG4细胞活性氧(ROS)水平;比色法检测CG4细胞总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量;衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测CG4细胞衰老变化;乳酸脱氢酶(LDH)法和calcein/PI双染法检测CG4细胞损伤和死亡情况;Western blot检测CG4细胞衰老相关蛋白p21和p53,以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/AKT)信号通路相关蛋白表达。结果:成功分离培养BMSCs,并构建NRG1-BMSCs。与control组相比,OGD/R组CG4细胞突起短小、分枝少;细胞活力、迁移能力及T-AOC水平均显著降低(P0.05)。结论:NRG1基因修饰的大鼠BMSCs在体外能够抑制OGD/R诱导的CG4细胞衰老及死亡,其作用机制可能与调节PI3K/AKT信号通路,减轻细胞氧化应激有关。

关键词：神经调节蛋白1 骨髓间充质干细胞少突胶质细胞氧糖剥夺/复氧氧化应激 PI3K/AKT信号通路

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丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺／复氧损伤及其机制

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药学学报 2008年第4期43卷 366-370页

作者：吴丽蓉罗勇重庆医科大学附属第一医院重庆市神经病学重点实验室重庆400016

本研究探讨丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧损伤及其机制。原代培养大鼠大脑皮质神经元,建立氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R),采用MTT法、酶学检查、免疫组化、RT-PCR等观察丁基苯酞(各浓度组)的保护作用及其机制。在氧糖剥夺4 h/... 详细信息

本研究探讨丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧损伤及其机制。原代培养大鼠大脑皮质神经元,建立氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R),采用MTT法、酶学检查、免疫组化、RT-PCR等观察丁基苯酞(各浓度组)的保护作用及其机制。在氧糖剥夺4 h/复氧8 h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH(乳酸脱氢酶)的释放,可显著降低神经元表达iNOS mRNA(诱生型一氧化氮合酶)和NF-κB(核因子κB)p65蛋白(增加)。不同剂量丁基苯酞(100、10、1和0.1μmol.L-1)在增加细胞活力、减少LDH释放及降低神经元表达iNOSmRNA等方面,高浓度的作用强于低浓度,且丁基苯酞100μmol.L-1组与吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)100μmol.L-1组差异显著。在OGD 4 h/R 8 h时丁基苯酞可能抑制iNOSmRNA的表达及NF-κB的活化,从而有效保护氧糖剥夺/复氧中损伤的大脑皮质神经元。

关键词：丁基苯酞核因子κB 氧糖剥夺/复氧大脑皮质神经元诱生型一氧化氮合酶