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毁灭炭疽菌诱抗蛋白的分离纯化及对烟草抗病促生作用

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中国烟草科学 2016年第4期37卷 68-73页

作者：田华陈光勇董瑜王静王贻鸿孔凡玉中国农业科学院烟草研究所青岛266101 中国农业科学院研究生院北京100081 云南省曲靖市烟草公司会泽分公司云南会泽654200

为明确诱抗蛋白能够对烟草产生抗病促生作用,采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶色谱柱等方法,从毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum)中分离纯化出一种诱抗蛋白,并采用喷雾接种和摩擦接种的方法研究其预防保护作用。结果... 详细信息

为明确诱抗蛋白能够对烟草产生抗病促生作用,采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶色谱柱等方法,从毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum)中分离纯化出一种诱抗蛋白,并采用喷雾接种和摩擦接种的方法研究其预防保护作用。结果表明,经SDS-PAGE显示该诱抗蛋白分子量约为38 k D,且目的蛋白存在于Pro-P2-TX组份中;对烟株进行烟草普通花叶病毒病的接种试验,接种3 d后,诱抗蛋白处理组烟草叶片枯斑数明显少于清水对照组,对TMV的诱抗效果为73.79%;该诱抗蛋白能够明显促进烟草的生长,诱导处理40 d后,烟草的株高、叶宽和茎围与清水对照相比明显增加,其中株高增长72.43%,叶宽和茎围分别增加61.06%和29.05%。因此,试验结果说明毁灭炭疽菌诱抗蛋白具有诱导烟草产生抗病性和促进烟草生长的作用。

关键词：诱抗蛋白毁灭炭疽菌分离纯化诱导抗病性烟草生长

毁灭炭疽菌RAPD和ISSR-PCR最佳反应体系的建立

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广东农业科学 2009年第5期36卷 94-98页

作者：邢红梅丁平王克荣周晓云广州花卉研究中心广东广州510360 南京农业大学植物保护学院江苏南京210095

对影响PCR反应的主要因子-Mg2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L。ISSR反应体... 详细信息

对影响PCR反应的主要因子-Mg2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L。ISSR反应体系(25μL)为:Mg2+浓度为2 mmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,Taq酶用量为0.5 U,引物浓度为1.25μmol/L。

关键词：毁灭炭疽菌 RAPD-PCR ISSR-PCR 优化体系

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红掌毁灭炭疽菌的分子检测

华中农业大学学报 2011年第5期30卷 589-593页

作者：邢红梅丁平王克荣周晓云广州花卉研究中心广州510360 南京农业大学植物保护学院南京210095

根据GenBank中炭疽属Colletotrichum不同种的ITS序列差异,设计了毁灭炭疽菌Colletotrichumdestructivum的特异性引物F1/ITS4,由此建立的PCR检测体系可以从80个毁灭炭疽菌菌株中扩增得到1条486bp的特异性条带,而扩增其他近似或相关种的... 详细信息

根据GenBank中炭疽属Colletotrichum不同种的ITS序列差异,设计了毁灭炭疽菌Colletotrichumdestructivum的特异性引物F1/ITS4,由此建立的PCR检测体系可以从80个毁灭炭疽菌菌株中扩增得到1条486bp的特异性条带,而扩增其他近似或相关种的菌株时没有相应的特异性条带。该检测体系对毁灭炭疽菌基因组DNA的扩增灵敏度达到10pg。将引物F1/ITS4与ITS区通用引物进行套式PCR扩增后,检测灵敏度至少提高10 000倍,每克土中含有200个毁灭炭疽菌分生孢子时即可检测出。进一步利用此检测体系对携带病原菌的灌溉水、发病组织进行检测,均能快速准确地检测出病原菌。

关键词：毁灭炭疽菌红掌分子检测套式PCR

烟草炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白及其作用分析

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烟草炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白及其作用分析

作者：田华中国农业科学院

学位级别：硕士

本研究采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶色谱柱等方法,首次从毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum中分离纯化出一种诱抗蛋白。为进一步确定该诱抗蛋白的生物活性,研究诱导烟株产生抗病性及对烟草悬浮细胞的作用,本试验以... 详细信息

本研究采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶色谱柱等方法,首次从毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum中分离纯化出一种诱抗蛋白。为进一步确定该诱抗蛋白的生物活性,研究诱导烟株产生抗病性及对烟草悬浮细胞的作用,本试验以毁灭炭疽菌诱抗蛋白、烟草植株以及烟草悬浮细胞为研究体系,采用喷雾接种和摩擦接种方法研究该诱抗蛋白的预防保护作用,采用半定量RT-PCR技术测定诱导过氧化物酶(Hydrogen peroxidase,POD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanin ammonialyase,PAL)活性及脯氨酸(Proline,PRO)含量和病程相关蛋白基因表达的变化。本研究最终从烟草炭疽菌Colletotrichum destructivum中纯化出一种新型的真菌源蛋白质激发子,并进一步研究了其诱导烟株产生抗病性及对烟草悬浮细胞的作用,为防治烟草病害提供了新的途径,同时为阐明该诱抗蛋白诱导烟草作用机制以及与植物互作奠定了基础。1.本试验采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀和透析的方法,从毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum中粗提出一种诱抗蛋白,属于蛋白质类激发子,通过SDS-PAGE蛋白电泳检测,得到该粗蛋白的分子量约为38kD。通过烟草种子萌发的试验表明,该诱抗蛋白处理的烟草种子与清水对照相比,出芽率高,整体长势整齐,茎明显长于对照组,处理的发芽情况明显好于对照,证明该诱抗蛋白有一定的诱导生物活性,可以进行下一步的试验。2.根据诱抗粗蛋白中分子量分布情况,选用Sephacryl S200(分离范围5-250 kD)凝胶色谱柱对其进行分离纯化,按照一定的色谱条件纯化后得到四个峰,按峰收集了4个组分,分别命名为Pro-P1 TX、Pro-P2 TX、Pro-P3 TX和Pro-P4 TX。将四个组分进行浓缩,浓缩后每个组分洗出大量的盐,上清部分通过Sephadex G10进行脱盐,盐析部分透析除盐。最后本实验室采用SDS-PAGE对分离纯化得到的蛋白组分进行检测,在Pro-P2 TX中发现了目的蛋白条带,其他组分中未发现,所以目的蛋白存在于Pro-P2-TX组分中。3.诱抗粗蛋白和诱抗纯蛋白能够诱导烟株产生抗病性。接种3、5和7 d后,毁灭炭疽菌诱抗粗蛋白对烟草炭疽病的诱抗效果分别为58.00%、48.99%和49.65%,对烟草白粉病的诱抗效果分别为83.26%、80.76%和78.60%,并可以抑制烟草普通花叶病毒的复制及在寄主体内的扩增。纯化后的诱抗蛋白对烟草普通花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)的诱抗效果为73.79%,处理组枯斑数明显少于对照组,并能够促进烟草的生长,诱导处理40 d后,烟草的株高、叶宽和茎围与对照相比明显增加。所以毁灭炭疽菌诱抗蛋白具有诱导烟草产生抗病性和促进烟草生长的作用。4.诱抗粗蛋白处理烟草悬浮细胞后,诱导过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及脯氨酸(PRO)含量产生变化。烟草悬浮细胞经诱抗蛋白处理后,POD、PPO、PAL活性及PRO含量明显提高,分别在8、12、6和12 h达到峰值;采用半定量RT-PCR技术验证了诱抗蛋白诱导烟草病程相关蛋白基因PR1a、PR1b以及抗病信号传导途径关键基因NPR1的表达。

关键词：毁灭炭疽菌诱抗蛋白分离纯化烟草悬浮细胞诱导抗病性

红心莲毁灭炭疽病菌生物学特性及高效安全药剂筛选

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福建农业学报 2022年第8期37卷 1067-1071页

作者：董金龙长泰金诺农业科技有限公司福建漳州363902

【目的】明确红心莲炭疽病菌毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum)的生物学特性。测定不同化学结构和作用机制的6种杀菌剂对毁灭炭疽菌的室内毒力,筛选高效安全杀菌剂。【方法】采用菌丝生长速率法测定温度、pH、光周期和碳、氮源... 详细信息

【目的】明确红心莲炭疽病菌毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum)的生物学特性。测定不同化学结构和作用机制的6种杀菌剂对毁灭炭疽菌的室内毒力,筛选高效安全杀菌剂。【方法】采用菌丝生长速率法测定温度、pH、光周期和碳、氮源对菌丝生长的影响,以及6种杀菌剂对毁灭炭疽菌抑制效果。【结果】毁灭炭疽菌菌丝生长最适温度为30℃、最适pH为8,光周期对菌丝生长影响小,最适碳、氮源分别为淀粉和酵母。室内毒力测定结果表明,所选的6种杀菌剂对病原菌毒力差异大,其中咯菌腈的毒力最强,EC50为0.0236 mg·L^(-1);其次为咪鲜胺和吡唑醚菌酯,EC50分别为0.0306和0.0487 mg·L^(-1);甲基硫菌灵和苯醚甲环唑的毒力较弱,EC50分别为0.1526和0.1955 mg·L^(-1);多菌灵的毒力最弱,EC50为0.2199 mg·L^(-1)。【结论】温度、pH、碳氮源对毁灭炭疽菌菌丝生长具有一定影响。咯菌腈、咪鲜胺和吡唑醚菌酯等杀菌剂对毁灭炭疽菌有较好的室内毒力。

关键词：红心莲毁灭炭疽菌生物学特性药剂毒力测定

红掌炭疽病病原的鉴定、分子检测及群体遗传多样性研究

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红掌炭疽病病原的鉴定、分子检测及群体遗传多样性研究

作者：邢红梅南京农业大学

学位级别：硕士

本文采用形态学和分子生物学两种方法对红掌炭疽病的病原进行了鉴定;并对红掌炭疽菌的分子检测进行了研究;同时建立了毁灭炭疽菌的RAPD-PCR和ISSR-PCR的最佳反应体系，对红掌上的5个毁灭炭疽菌地理群体和1个胶孢炭疽菌地理群体进行了RAP... 详细信息

本文采用形态学和分子生物学两种方法对红掌炭疽病的病原进行了鉴定;并对红掌炭疽菌的分子检测进行了研究;同时建立了毁灭炭疽菌的RAPD-PCR和ISSR-PCR的最佳反应体系，对红掌上的5个毁灭炭疽菌地理群体和1个胶孢炭疽菌地理群体进行了RAPD和ISSR分析。红掌炭疽茵的收集与鉴定：从广州、扬州、南京等地采集红掌炭疽茵，在经单孢分离得到的炭疽菌中，存在形态差异明显的两个群体。每个群体各选取2个代表菌株，进行形态特征，致病性，寄主范围鉴定及核糖体DNA-ITS序列分析。结果表明：红掌上有两种致病菌，胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum)，后者是首次报道在红掌上致病，且发现为优势种;两者可单独侵染，也可复合侵染，都具有潜伏侵染的特性。红掌炭疽菌的分子检测：根据Colletotrichum 33个种的核糖体转录间隔区(ITS)序列差异设计的两对种特异性引物E1／E2，F1／ITS4，可以分别特异地从红掌上的胶孢炭疽菌和毁灭炭疽菌菌株中扩增到一条329 bp和486 bp的条带，而从其它供试菌株中不能扩增出该条带。这两个检测体系对纯基因组DNA的扩增灵敏度均达到10pg;将这两对引物分别与ITS区通用引物进行套式PCR后检测灵敏度菌均至少可提高10000倍;当1g土中达到200个分生孢子均可被检测出;进一步利用这两个检测体系对携带病原菌的灌溉水、发病组织进行检测，均能快速稳定地检测出病原菌。毁灭炭疽茵基因组RAPD，ISSR-PCR体系的建立：对影响PCR反应的主要因子：Mg+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化，建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(25μl)：Mg浓度2.5mmol／L，dNTP浓度200μmol／L，Taq酶用量IU，引物浓度1μmol／L。ISSR反应体系(25μl)为：Mg浓度2mmol／L，dNTP浓度150μmol／L，Taq酶用量0.5U，引物浓度1.25μmol／L。炭疽菌基因组RAPD和ISSR指纹图谱分析：采用RAPD和ISSR分析技术对来自于广州、南京等地红掌上的五个毁灭炭疽菌地理群体和来自广州红掌上的一个胶孢炭疽菌地理群体的DNA指纹图谱进行了分析。结果表明：11条RAPD引物共扩增出155条条带，其中多态性条带比例为96.13％，而10条ISSR引物扩增出101条条带，多态性条带比例为98.02％。无论是RAPD还是ISSR分析都表明：六个地理群体中，广州花都的胶孢炭疽群体遗传变异最大，群体遗传多样性最为丰富，其次则以广州花都的毁灭炭疽群体遗传变异最大;六个地理群体中，广州花都的毁灭炭疽菌群体与广州番禺的毁灭炭疽菌群体遗传相似性最高，而广州花都的胶孢炭疽菌群体遗传距离最远。

关键词：红掌胶孢炭疽菌毁灭炭疽菌分子检测 RAPD ISSR