红掌炭疽病病原的鉴定、分子检测及群体遗传多样性研究

作     者：邢红梅 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王克荣

授予年度：2007年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：红掌 胶孢炭疽菌 毁灭炭疽菌 分子检测 RAPD ISSR 

摘      要：本文采用形态学和分子生物学两种方法对红掌炭疽病的病原进行了鉴定;并对红掌炭疽菌的分子检测进行了研究;同时建立了毁灭炭疽菌的RAPD-PCR和ISSR-PCR的最佳反应体系，对红掌上的5个毁灭炭疽菌地理群体和1个胶孢炭疽菌地理群体进行了RAPD和ISSR分析。 红掌炭疽茵的收集与鉴定：从广州、扬州、南京等地采集红掌炭疽茵，在经单孢分离得到的炭疽菌中，存在形态差异明显的两个群体。每个群体各选取2个代表菌株，进行形态特征，致病性，寄主范围鉴定及核糖体DNA-ITS序列分析。结果表明：红掌上有两种致病菌，胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum)，后者是首次报道在红掌上致病，且发现为优势种;两者可单独侵染，也可复合侵染，都具有潜伏侵染的特性。 红掌炭疽菌的分子检测：根据Colletotrichum 33个种的核糖体转录间隔区(ITS)序列差异设计的两对种特异性引物E1／E2，F1／ITS4，可以分别特异地从红掌上的胶孢炭疽菌和毁灭炭疽菌菌株中扩增到一条329 bp和486 bp的条带，而从其它供试菌株中不能扩增出该条带。这两个检测体系对纯基因组DNA的扩增灵敏度均达到10pg;将这两对引物分别与ITS区通用引物进行套式PCR后检测灵敏度菌均至少可提高10000倍;当1g土中达到200个分生孢子均可被检测出;进一步利用这两个检测体系对携带病原菌的灌溉水、发病组织进行检测，均能快速稳定地检测出病原菌。 毁灭炭疽茵基因组RAPD，ISSR-PCR体系的建立：对影响PCR反应的主要因子：Mg+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化，建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(25μl)：Mg浓度2.5mmol／L，dNTP浓度200μmol／L，Taq酶用量IU，引物浓度1μmol／L。ISSR反应体系(25μl)为：Mg浓度2mmol／L，dNTP浓度150μmol／L，Taq酶用量0.5U，引物浓度1.25μmol／L。 炭疽菌基因组RAPD和ISSR指纹图谱分析：采用RAPD和ISSR分析技术对来自于广州、南京等地红掌上的五个毁灭炭疽菌地理群体和来自广州红掌上的一个胶孢炭疽菌地理群体的DNA指纹图谱进行了分析。结果表明：11条RAPD引物共扩增出155条条带，其中多态性条带比例为96.13％，而10条ISSR引物扩增出101条条带，多态性条带比例为98.02％。无论是RAPD还是ISSR分析都表明：六个地理群体中，广州花都的胶孢炭疽群体遗传变异最大，群体遗传多样性最为丰富，其次则以广州花都的毁灭炭疽群体遗传变异最大;六个地理群体中，广州花都的毁灭炭疽菌群体与广州番禺的毁灭炭疽菌群体遗传相似性最高，而广州花都的胶孢炭疽菌群体遗传距离最远。