烟草炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白及其作用分析

作     者：田华 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：孔凡玉

授予年度：2016年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：毁灭炭疽菌 诱抗蛋白 分离纯化 烟草悬浮细胞 诱导抗病性 

摘      要：本研究采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶色谱柱等方法,首次从毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum中分离纯化出一种诱抗蛋白。为进一步确定该诱抗蛋白的生物活性,研究诱导烟株产生抗病性及对烟草悬浮细胞的作用,本试验以毁灭炭疽菌诱抗蛋白、烟草植株以及烟草悬浮细胞为研究体系,采用喷雾接种和摩擦接种方法研究该诱抗蛋白的预防保护作用,采用半定量RT-PCR技术测定诱导过氧化物酶(Hydrogen peroxidase,POD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanin ammonialyase,PAL)活性及脯氨酸(Proline,PRO)含量和病程相关蛋白基因表达的变化。本研究最终从烟草炭疽菌Colletotrichum destructivum中纯化出一种新型的真菌源蛋白质激发子,并进一步研究了其诱导烟株产生抗病性及对烟草悬浮细胞的作用,为防治烟草病害提供了新的途径,同时为阐明该诱抗蛋白诱导烟草作用机制以及与植物互作奠定了基础。1.本试验采用加热、离心、硫酸铵分级沉淀和透析的方法,从毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum中粗提出一种诱抗蛋白,属于蛋白质类激发子,通过SDS-PAGE蛋白电泳检测,得到该粗蛋白的分子量约为38kD。通过烟草种子萌发的试验表明,该诱抗蛋白处理的烟草种子与清水对照相比,出芽率高,整体长势整齐,茎明显长于对照组,处理的发芽情况明显好于对照,证明该诱抗蛋白有一定的诱导生物活性,可以进行下一步的试验。2.根据诱抗粗蛋白中分子量分布情况,选用Sephacryl S200(分离范围5-250 kD)凝胶色谱柱对其进行分离纯化,按照一定的色谱条件纯化后得到四个峰,按峰收集了4个组分,分别命名为Pro-P1 TX、Pro-P2 TX、Pro-P3 TX和Pro-P4 TX。将四个组分进行浓缩,浓缩后每个组分洗出大量的盐,上清部分通过Sephadex G10进行脱盐,盐析部分透析除盐。最后本实验室采用SDS-PAGE对分离纯化得到的蛋白组分进行检测,在Pro-P2 TX中发现了目的蛋白条带,其他组分中未发现,所以目的蛋白存在于Pro-P2-TX组分中。3.诱抗粗蛋白和诱抗纯蛋白能够诱导烟株产生抗病性。接种3、5和7 d后,毁灭炭疽菌诱抗粗蛋白对烟草炭疽病的诱抗效果分别为58.00%、48.99%和49.65%,对烟草白粉病的诱抗效果分别为83.26%、80.76%和78.60%,并可以抑制烟草普通花叶病毒的复制及在寄主体内的扩增。纯化后的诱抗蛋白对烟草普通花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)的诱抗效果为73.79%,处理组枯斑数明显少于对照组,并能够促进烟草的生长,诱导处理40 d后,烟草的株高、叶宽和茎围与对照相比明显增加。所以毁灭炭疽菌诱抗蛋白具有诱导烟草产生抗病性和促进烟草生长的作用。4.诱抗粗蛋白处理烟草悬浮细胞后,诱导过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及脯氨酸(PRO)含量产生变化。烟草悬浮细胞经诱抗蛋白处理后,POD、PPO、PAL活性及PRO含量明显提高,分别在8、12、6和12 h达到峰值;采用半定量RT-PCR技术验证了诱抗蛋白诱导烟草病程相关蛋白基因PR1a、PR1b以及抗病信号传导途径关键基因NPR1的表达。