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欧当归内酯A对血瘀证大鼠血液流变学和内皮细胞损伤保护的研究

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欧当归内酯A对血瘀证大鼠血液流变学和内皮细胞损伤保护的研究

作者：刘校彤西南医科大学

学位级别：硕士

目的:在大鼠血瘀证动物模型基础上,探讨欧当归内酯A(Levistilide A,LA)在血瘀证中的作用,以及在建立人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的损伤模型基础上,验证LA对其的保护作用及可能的机制。方法:选择体... 详细信息

目的:在大鼠血瘀证动物模型基础上,探讨欧当归内酯A(Levistilide A,LA)在血瘀证中的作用,以及在建立人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的损伤模型基础上,验证LA对其的保护作用及可能的机制。方法:选择体重300g左右的SD雄性大鼠,随机分为对照组(Control)、血瘀证模型组(Model)、模型+阿司匹林干预组(Model+Asprin)、模型+LA低剂量组(Model+LA5mg/kg)、模型+LA高剂量组(Model+LA10mg/kg)。对各模型组大鼠行皮下肾上腺素注射+游泳力竭处理复合冰水浴造成血瘀证大鼠模型,采血检测凝血和血液流变学相关指标,取大鼠颈动脉做苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)染色观察血管内皮形态。体外实验中,选处于对数生长期的细胞,同步化处理后分组:空白组(Control)、HO模型组(Model)、模型+LA预处理组(Model+LA5μmol/L)。用CCK8法检测细胞活力;通过网络药理学和分子对接,筛选出PI3K-AKT信号通路,再检测各组的相关蛋白的表达情况。结果:1.凝血指标结果相较于对照组,模型组:FIB升高(P欧当归内酯A的干预,可以改善血液高凝和高粘滞状态,提高内皮细胞活性并且对内皮细胞有一定的保护作用,其机制可能是调控PI3K-AKT-e NOs通路来实现的。

关键词：血瘀证欧当归内酯A 血管内皮损伤人脐静脉内皮细胞

低剂量欧当归内酯A对HepG2肝癌细胞衰老及DNA损伤反应的影响

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低剂量欧当归内酯A对HepG2肝癌细胞衰老及DNA损伤反应的影响

作者：南宗佑山西大学

学位级别：硕士

川芎是一种常见的药食同源天然植物,欧当归内酯A（Levistolide A,LA）为提取自植物川芎根部的单体化合物。目前有研究结果表明:LA以浓度和时间依赖的方式,显著抑制HCT116结肠癌细胞增殖并促进凋亡;并且LA的抗结肠癌作用不依赖于p53。根... 详细信息

川芎是一种常见的药食同源天然植物,欧当归内酯A（Levistolide A,LA）为提取自植物川芎根部的单体化合物。目前有研究结果表明:LA以浓度和时间依赖的方式,显著抑制HCT116结肠癌细胞增殖并促进凋亡;并且LA的抗结肠癌作用不依赖于p53。根据最新报道,LA能抑制非小细胞肺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡;裸鼠体内注射H1299细胞,与抗肿瘤常用药物顺铂相比,LA表现出更好的抗肿瘤活性。但LA是否具有抗肝癌作用及LA对肿瘤细胞衰老的作用尚未见研究报道,仍需进一步研究揭示。为了研究LA对肝癌细胞是否具有生长抑制作用以及LA对肝癌细胞衰老的影响,本研究选择HepG2细胞为研究对象,采用MTT实验检测LA对肝癌细胞的生长抑制作用;β-半乳糖苷酶染色观察检测低剂量LA对肝癌细胞衰老的影响;利用普通PCR和实时荧光定量PCR技术检测经低剂量LA处理后的肝癌细胞衰老标志基因表达量的变化;利用Western blot实验检测低剂量LA对肝癌细胞DNA损伤反应的影响。研究结果如下:1.LA对肝癌细胞有明显的生长抑制作用,且低剂量的LA可以显著诱导肝癌细胞衰老的发生。通过MTT检测LA对HepG2细胞增殖的影响,结果显示,LA能显著抑制肝癌细胞的细胞活性,且呈现剂量依赖效应。低剂量的LA（6.25μM、12.5μM）持续处理HepG2细胞48 h后,通过经典的细胞衰老检测方法β-半乳糖苷酶染色发现,低剂量LA诱使肝癌细胞出现衰老,且呈现出剂量依赖效应。2.低剂量LA诱导肝癌细胞衰老相关基因和DNA损伤相关蛋白的表达。低剂量欧当归内酯A（6.25μM、12.5μM）处理HepG2细胞48 h后,采用Trizol法提取处理后细胞的总RNA,半定量PCR和实时荧光定量PCR实验检测衰老相关基因p53、p21和IL-1β的表达,结果显示,处理组细胞中上述基因的表达量较对照组均明显升高。通过Western blot进一步检测细胞中DNA损伤相关蛋白γ-H2AX、p-ATM和p-Chk2的表达,结果表明,处理组细胞上述蛋白的表达量较对照组均以浓度依赖的方式显著升高。上述结果表明,低剂量欧当归内酯A作用HepG2细胞48 h后会激活DNA损伤反应通路,使p53活性增强,调控下游的细胞周期蛋白激酶抑制因子p21从而诱导细胞衰老的发生。综上所述,LA对肝癌细胞有抑制作用,且低剂量LA还会介导肝癌细胞衰老及DNA损伤反应的发生。通过本论文的研究,以期能为临床中肝癌的治疗提供新思路,也为抗肿瘤新药的开发奠定基础和提供理论依据。

关键词：欧当归内酯A 细胞衰老 DNA损伤

欧当归内酯A诱导结肠癌细胞调亡的作用及机制研究

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欧当归内酯A诱导结肠癌细胞调亡的作用及机制研究

作者：张艳花山西大学

学位级别：硕士

结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）发病率在恶性肿瘤中居全球第3位,同时也是我国常见恶性肿瘤之一。近年来随着环境日益恶化、不良的生活方式及人口老龄化等因素,其发病率和死亡率逐年趋增。目前结肠癌主要的治疗方案是手术与化疗相结... 详细信息

结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）发病率在恶性肿瘤中居全球第3位,同时也是我国常见恶性肿瘤之一。近年来随着环境日益恶化、不良的生活方式及人口老龄化等因素,其发病率和死亡率逐年趋增。目前结肠癌主要的治疗方案是手术与化疗相结合,但是在治疗过程中,肿瘤的耐药性和药物给机体自身带来的副作用严重阻碍了癌症的治疗。因此,寻找更安全、更有效的抗癌新药物成为肿瘤治疗亟待解决的问题。天然化合物是抗癌新药物的主要来源,川芎是我国传统中药之一,其活性成分欧当归内酯A（Levistolide,LA）是从其根部所提取出来的一种天然化合物。目前关于LA抑癌机理的研究未见报道。为探究LA对肿瘤细胞的作用及机制,本研究结果主要包括以下三个方面:1.LA抑制多种肿瘤细胞增殖并且诱导结肠癌细胞凋亡。通过MTT实验分别检测LA对HCT116、HCT116 p53-/-、HT29,HepG2以及Hela细胞增殖的影响。结果表明,LA能够显著抑制这5种肿瘤细胞的生长,并呈现出时间和剂量依赖效应,其中结肠癌HCT116细胞对LA最为敏感,其半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）为100μM。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放法检测表明LA处理HCT116细胞24 h不会引起细胞坏死。以结肠癌一线化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）作为诱导细胞凋亡的阳性对照,LA处理HCT116、HCT116 p53-/-细胞,通过流式细胞术检测发现细胞凋亡率呈剂量依赖式增加。为了进一步验证LA诱导细胞凋亡,我们检测了LA处理后Caspase 3活性的变化与凋亡相关蛋白Cleaved-PARP的表达,结果显示,LA处理细胞24 h后,结肠癌细胞的Caspase 3活性与Cleaved-PARP蛋白水平均升高。2.为了检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）是否参与调控LA诱导的细胞凋亡,通过流式细胞术检测细胞内活性氧水平的变化。结果表明,LA处理引起HCT116细胞内ROS水平显著升高;当加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-Lcysteine,NAC）进行干预后,ROS水平被显著抑制,细胞凋亡率下降,细胞活性升高。结果表明,ROS参与了LA诱导的结肠癌细胞凋亡。3.探究LA诱导HCT116细胞凋亡的分子机制。通过Western blot实验检测内质网应激相关蛋白,结果显示,LA处理HCT116细胞显著激活了内质网应激,主要通过Bip-eIF2α-CHOP通路激发凋亡。当通过siRNA技术敲低CHOP蛋白的表达时,LA引起的凋亡受到抑制。而加入抗氧化剂NAC进行干预后,内质网应激相关蛋白的表达水平降低。结果表明,LA通过激活ROS介导的内质网应激途径诱导结肠癌细胞凋亡。综上所述,本研究发现LA显著抑制HCT116、HCT116 p53-/-、HT29,HepG2以及Hela细胞增殖并诱导HCT116、HCT116 p53-/-细胞凋亡,且LA通过升高HCT116细胞内ROS水平激活内质网应激途径诱导结肠癌细胞凋亡。本研究将为LA开发新型抗结肠癌肿瘤药物提供新思路,有利于进一步提高临床放化疗效果,为逆转肿瘤耐药提供新依据。

关键词：欧当归内酯A 凋亡活性氧内质网应激

欧当归内酯A的生物利用度及其对Aβ清除的影响

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欧当归内酯A的生物利用度及其对Aβ清除的影响

作者：何文青广州中医药大学

学位级别：硕士

背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)即老年性痴呆,是常见的进行性加重的神经退行性疾病,可因并发症而死亡。发病率随年龄而增加,患病率随着步入老龄化社会而逐步增加。AD将成为医学界和公众都关注的重大健康问题,且目前并无... 详细信息

背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)即老年性痴呆,是常见的进行性加重的神经退行性疾病,可因并发症而死亡。发病率随年龄而增加,患病率随着步入老龄化社会而逐步增加。AD将成为医学界和公众都关注的重大健康问题,且目前并无理想的治疗药物,而中医药相关研究因其多途径、多靶点的治疗机制正成为研究热点。目的：探讨LA对M146L细胞(双转APP/PS1基因的CHO细胞)胞内及胞外Aβ1-42的调节作用及作用机制,为抗AD的研究提供参考。并通过探讨当归芍药散醇提物、川芎醇提物和川芎有效成分欧当归内酯A (levistolide A, LA)的含量测定及其在SD大鼠血浆和脑中的药代动力学过程,研究提高欧当归内酯A的生物利用度的方法,为延长吸收寻找更有效的手段。方法：1.药效学实验(1)不同浓度LA对M146L的细胞活力测定(CCK-8法)：检测细胞存活率,明确药物的无毒最佳浓度和作用时间。(2)ELISA法检测LA对M146L细胞中Apl-42产生量的影响。(3)用Western blot法检测LA作用于M146L细胞后,对细胞内外Aβl-42蛋白表达量的影响。2.药动学实验(1)川芎醇提物和当归芍药散醇提物中LA的含量测定分别制备当归芍药散醇提物和川芎醇提物,建立并验证LA含量测定的HPLC-UV方法,包括线性,准确性,重复性,检测限,定量限,稳定性的验证。(2)LA与川芎醇提物和当归芍药散醇提物中LA的药代动力学比较研究①建立LC-MS/MS测定大鼠LA血药浓度法。32只300g左右雄性SD鼠随机分为4组：单体灌胃组、药材灌胃组、复方灌胃组(剂量为20mg/kg)和单体静注组(剂量为2mg/kg),在相应时间点予连续眼球后静脉取血,于LC-MS/MS中测定其血药含量,绘制时间-药物浓度曲线,用NONMEM Program version 1.1软件拟合药动参数,并对各组药动参数进行比较。②建立LC-MS/MS测定大鼠LA脑药浓度法。把24只300g左右的雄性SD大鼠随机分为4组,每组6只,尾静脉注射LA 2mg/kg,于给药后0.03,0.17,0.5,4h断头取脑。于LC-MS/MS中测定其脑药含量,绘制时间-药物浓度曲线,用NONMEM Program version 1.1软件拟合药动参数,进行比较。结果：1.药效学实验：(1)浓度为20mmol/L的LA溶液对细胞活性有影响,浓度为15,10,5,1, 0mmol/L的LA溶液(DMSO终浓度为0.08%)对细胞活性没有影响,无细胞毒性。(2)ELISA实验结果显示,使用不同浓度的LA对M146L细胞干预24小时后,15mM、10mM的浓度均能降低细胞外Aβ1-42的含量(P当归芍药散醇提物和川芎醇提物中LA含量测定的HPLC-UV方法符合体外药物含量测定的方法学要求。经测定,当归芍药散醇提物和川芎醇提物中LA的含量分别为0.11996和3.2%。(2)经方法学验证,大鼠血浆中当归芍药散醇提物和川芎醇提物中LA含量测定的HPLC方法符合体外药物含量测定的方法学指导原则的要求。测定各组LA的血药浓度并进行数据分析发现,LA在SD大鼠血浆内的药动学过程为二房室模型。复方组的t1/2和AUCo→∞值比其他组的大(P当归芍药散醇提物和川芎醇提物中LA含量测定的HPLC-UV方法符合体外药物含量测定方法学指导原则的要求。测定各组LA的脑药浓度并进行数据分析发现,LA能透过血脑屏障,在给药后30分钟达到最大浓度(约43ng/mL) 。结论：1.LA能透过血脑屏障,从而发挥对Aβ1-42的清除作用,这可能与其调节血脑屏障上的转运体,从而外排Aβ,使之减少在脑中的积聚的机制有关,对AD的治疗研究上可能具有一定的价值和意义。2.本研究建立并验证了快速、简便、可重复和稳定可行的欧当归内酯A含量的LC-MS/MS测定方法,并用于大鼠体内的药代动力学研究。3.与LA单体和川芎醇提物比较,当归芍药散能显著提高LA的生物利用度,给药方便且低风险,吸收程度高和作用时间更长。

关键词：阿尔兹海默病 β淀粉样蛋白当归芍药散欧当归内酯A 血脑屏障

欧当归内酯A对实验性纤维化肝脏NO及内皮细胞功能的影响

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世界中医药 2020年第19期15卷 2850-2856页

作者：赵志敏黄恺沈丽刘成海叶伟成上海中医药大学附属曙光医院·肝病研究所上海201203 上海市中医临床重点实验室上海201203

目的:探讨欧当归内酯A调节纤维化肝脏NO释放的抗肝纤维化作用机制。方法:40只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、欧当归内酯A 3 mg/kg组、欧当归内酯A 6 mg/kg组,每组10只。以四氯化碳(CCl4)与高脂低蛋白饮食复合因素诱导肝纤维化模型... 详细信息

目的:探讨欧当归内酯A调节纤维化肝脏NO释放的抗肝纤维化作用机制。方法:40只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、欧当归内酯A 3 mg/kg组、欧当归内酯A 6 mg/kg组,每组10只。以四氯化碳(CCl4)与高脂低蛋白饮食复合因素诱导肝纤维化模型,连续6周。药物观察组于造模第4周腹腔注射给药至结束。观察肝组织炎性反应及胶原沉积、eNOS表达及MDA、SOD、NO、NOS水平。体外以800μmol/L氯化钴作用于SK-HEP-1细胞24 h诱导细胞缺氧损伤,药物处理后观察细胞活力、vWF表达、上清及胞内NO水平。结果:与模型组比较,欧当归内酯A各组肝细胞变性和炎性反应坏死有所减轻,纤维化改善;高剂量组SOD和MDA显著改善,NO和NOS降低,eNOS阳性表达下降(P欧当归内酯A具有抗肝纤维化的作用,其机制可能与抗脂质过氧化损伤,改善内皮细胞功能,调节NO释放有关。

关键词：肝纤维化欧当归内酯A 内皮细胞一氧化氮机制

HPLC法测定新田七痛经胶囊中藁本内酯和欧当归内酯A的含量

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HPLC法测定新田七痛经胶囊中藁本内酯和欧当归内酯A的含量

2016年广东省药师周大会

作者：梁秀清廖卫国王利胜广州中医药大学中药学院

目的:建立新田七痛经胶囊中藁本内酯和欧当归内酯A含量测定方法。方法:采用HPLC法对制剂中藁本内酯和欧当归内酯A进行含量测定。结果:藁本内酯和欧当归内酯A能同时在HPLC中进行测定,藁本内酯的进样量在34.545μg/m L,线性范围内与峰面... 详细信息

目的:建立新田七痛经胶囊中藁本内酯和欧当归内酯A含量测定方法。方法:采用HPLC法对制剂中藁本内酯和欧当归内酯A进行含量测定。结果:藁本内酯和欧当归内酯A能同时在HPLC中进行测定,藁本内酯的进样量在34.545μg/m L,线性范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999,n=5);平均回收率为99.76%(RSD=1.10%)。欧当归内酯A的进样量在0.145.9μg/m L线性范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9997,n=5);平均回收率为99.94%(RSD=1.73%)。结论:所建立的方法简便可靠,可有效控制新田七痛经胶囊的质量。

关键词：新田七痛经胶囊藁本内酯欧当归内酯A HPLC

来源： cnki会议评论

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川芎有效成分欧当归内酯A的测定与分离研究

徐州工程学院学报（自然科学版） 2017年第3期32卷 1-7页

作者：韩伟王俊超徐婷华东理工大学药学院中药现代化工程中心上海200237

采用HPLC法测定川芎中欧当归内酯A含量,并对分析方法进行了方法学考察;在此基础上采用高速逆流色谱法和柱层析法对欧当归内酯A进行了分离制备.精密度、重复性和稳定性的RSD值均小于1%,回收率大于98%,表明HPLC法适合川芎中欧当归内酯A含... 详细信息

采用HPLC法测定川芎中欧当归内酯A含量,并对分析方法进行了方法学考察;在此基础上采用高速逆流色谱法和柱层析法对欧当归内酯A进行了分离制备.精密度、重复性和稳定性的RSD值均小于1%,回收率大于98%,表明HPLC法适合川芎中欧当归内酯A含量的测定.利用高速逆流色谱技术,从800 mg乙酸乙酯提取物中得到欧当归内酯A 4.55 mg,纯度达到98.63%,回收率98.42%;采用柱层析法从川芎的石油醚提取物680g中能得到静置结晶的欧当归内酯A 1.827g(纯度为99.56%),将剩余油状物经结晶与重结晶,得到欧当归内酯A 0.835g(纯度99.37%).

关键词：川芎欧当归内酯A 高速逆流色谱柱层析

RP-HPLC法测定田七痛经胶囊中阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A

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药物评价研究 2018年第9期41卷 1657-1660页

作者：张静娇康凯赵月然高珊胡景莲大连市药品检验所辽宁大连116000

目的建立高效液相色谱法测定田七痛经胶囊中阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A的方法。方法选用Thermo Acclaim C_(18)色谱柱,Thermo SCIENTIFICSyncronis C18色谱柱;检测波长为321、280 nm;体积流量1.0 m L/min;柱温35℃结果阿魏酸、藁本... 详细信息

目的建立高效液相色谱法测定田七痛经胶囊中阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A的方法。方法选用Thermo Acclaim C_(18)色谱柱,Thermo SCIENTIFICSyncronis C18色谱柱;检测波长为321、280 nm;体积流量1.0 m L/min;柱温35℃结果阿魏酸、藁本内酯、欧当归内酯A的质量浓度与峰面积分别在1.12~112.30、1.33~132.60、0.96~95.50μg/m L呈良好的线性关系;回归方程分别为Y=46 335 540 X+44 186.71(r=0.998),Y=14 514 060 X+8 715.27(r=0.999),Y=22 031 250 X+16 472.10(r=0.999)。结论该方法准确,简便,灵敏,可作为田七痛经胶囊质量控制的方法。

关键词：田七痛经胶囊阿魏酸藁本内酯欧当归内酯A

钾素对当归阿魏酸松柏酯、丁烯基酞内酯及欧当归内酯A含量的影响

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甘肃中医学院学报 2017年第1期34卷 30-34页

作者：杨雪王引权樊秦荔淑楠姚周玲王丽娜杨栋甘肃中医药大学药学院甘肃兰州730000 甘肃省中药质量与标准研究重点实验室培育基地甘肃兰州730000

目的研究不同钾素(K_2O)施用量对当归阿魏酸松柏酯、丁烯基酞内酯及欧当归内酯A累积量的影响。方法以钾素(K_2O)施用量为试验因素,设150(K_1),300(K_2),450(K_3),600(K_4),750 kg/hm^2(K_5)5个处理。田间试验采用随机区组设计,每个处理... 详细信息

目的研究不同钾素(K_2O)施用量对当归阿魏酸松柏酯、丁烯基酞内酯及欧当归内酯A累积量的影响。方法以钾素(K_2O)施用量为试验因素,设150(K_1),300(K_2),450(K_3),600(K_4),750 kg/hm^2(K_5)5个处理。田间试验采用随机区组设计,每个处理重复3次。在7—11月当归叶盛期到采收期,每25 d左右在田间取样1次,每次取样5株。采用高效液相色谱(HPLC)法测定不同生长期当归根系中阿魏酸松柏酯、丁烯基酞内酯及欧当归内酯A的含量。结果钾素施用量对当归阿魏酸松柏酯含量影响显著(P当归品质的形成。

关键词：当归阿魏酸松柏酯丁烯基酞内酯欧当归内酯A 钾素含量