低剂量欧当归内酯A对HepG2肝癌细胞衰老及DNA损伤反应的影响

作     者：南宗佑 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨映娟

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：欧当归内酯A 细胞衰老 DNA损伤 

摘      要：川芎是一种常见的药食同源天然植物,欧当归内酯A（Levistolide A,LA）为提取自植物川芎根部的单体化合物。目前有研究结果表明:LA以浓度和时间依赖的方式,显著抑制HCT116结肠癌细胞增殖并促进凋亡;并且LA的抗结肠癌作用不依赖于p53。根据最新报道,LA能抑制非小细胞肺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡;裸鼠体内注射H1299细胞,与抗肿瘤常用药物顺铂相比,LA表现出更好的抗肿瘤活性。但LA是否具有抗肝癌作用及LA对肿瘤细胞衰老的作用尚未见研究报道,仍需进一步研究揭示。为了研究LA对肝癌细胞是否具有生长抑制作用以及LA对肝癌细胞衰老的影响,本研究选择HepG2细胞为研究对象,采用MTT实验检测LA对肝癌细胞的生长抑制作用;β-半乳糖苷酶染色观察检测低剂量LA对肝癌细胞衰老的影响;利用普通PCR和实时荧光定量PCR技术检测经低剂量LA处理后的肝癌细胞衰老标志基因表达量的变化;利用Western blot实验检测低剂量LA对肝癌细胞DNA损伤反应的影响。研究结果如下:1.LA对肝癌细胞有明显的生长抑制作用,且低剂量的LA可以显著诱导肝癌细胞衰老的发生。通过MTT检测LA对HepG2细胞增殖的影响,结果显示,LA能显著抑制肝癌细胞的细胞活性,且呈现剂量依赖效应。低剂量的LA（6.25μM、12.5μM）持续处理HepG2细胞48 h后,通过经典的细胞衰老检测方法β-半乳糖苷酶染色发现,低剂量LA诱使肝癌细胞出现衰老,且呈现出剂量依赖效应。2.低剂量LA诱导肝癌细胞衰老相关基因和DNA损伤相关蛋白的表达。低剂量欧当归内酯A（6.25μM、12.5μM）处理HepG2细胞48 h后,采用Trizol法提取处理后细胞的总RNA,半定量PCR和实时荧光定量PCR实验检测衰老相关基因p53、p21和IL-1β的表达,结果显示,处理组细胞中上述基因的表达量较对照组均明显升高。通过Western blot进一步检测细胞中DNA损伤相关蛋白γ-H2AX、p-ATM和p-Chk2的表达,结果表明,处理组细胞上述蛋白的表达量较对照组均以浓度依赖的方式显著升高。上述结果表明,低剂量欧当归内酯A作用HepG2细胞48 h后会激活DNA损伤反应通路,使p53活性增强,调控下游的细胞周期蛋白激酶抑制因子p21从而诱导细胞衰老的发生。综上所述,LA对肝癌细胞有抑制作用,且低剂量LA还会介导肝癌细胞衰老及DNA损伤反应的发生。通过本论文的研究,以期能为临床中肝癌的治疗提供新思路,也为抗肿瘤新药的开发奠定基础和提供理论依据。