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HA蛋白S227N突变对基于新城疫病毒载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫原性的影响

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 711-717页

作者：傅彦贇石磊杨星竹胡娇胡增垒扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

为了评价HA蛋白S227N突变对基于新城疫病毒(NDV)载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫原性的影响,本研究向NDV载体携带的H7N9 HA蛋白中引入S227N突变,用反向遗传学技术拯救重组NDV,评价重组病毒的生物学特性与对鸡的免疫原性。结果显示,表达HAS... 详细信息

为了评价HA蛋白S227N突变对基于新城疫病毒(NDV)载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫原性的影响,本研究向NDV载体携带的H7N9 HA蛋白中引入S227N突变,用反向遗传学技术拯救重组NDV,评价重组病毒的生物学特性与对鸡的免疫原性。结果显示,表达HAS227N的重组NDV的毒力弱(MDT>120 h),在鸡胚中的病毒效价高(HA效价:512;EID_(50):10^(9.3)/m L),复制性能较强,这些生物学特征与载体病毒及表达野生型HA蛋白的重组NDV相似。S227N突变不影响HA蛋白在重组NDV感染细胞中的表达。此外,表达HAS227N与野生型HA蛋白的重组NDV均能诱导产生较高的抗NDV血凝抑制(HI)抗体;HA蛋白S227N突变能够提高重组NDV免疫鸡的血清转化率,却不能显著提升针对H7N9的HI抗体效价。上述结果表明,HA蛋白S227N突变对基于NDV载体的H7N9亚型禽流感疫苗的免疫原性没有显著的增强作用。本研究对H7N9亚型禽流感疫苗的设计、优化与效力评估有参考意义。

关键词： H7N9亚型禽流感病毒疫苗新城疫病毒载体 HA蛋白 S227N突变免疫原性

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重组新城疫病毒载体疫苗研究进展

动物医学进展 2022年第8期43卷 78-83页

作者：王芳楚富茗王秋霞卢浪蔡畅张新李文霞裴大伟刘兴友河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 新乡学院河南新乡453003 厚德食品股份有限公司吉林辽源136200

新城疫病毒(NDV)作为疫苗载体可以在宿主的呼吸道组织细胞中有效复制,诱导产生针对外来抗原的局部和全身免疫反应。NDV的基因组较大,可以很好地容纳外源基因。作为RNA病毒,与宿主细胞发生DNA重组的可能性较小。由于宿主范围的限制,人群... 详细信息

新城疫病毒(NDV)作为疫苗载体可以在宿主的呼吸道组织细胞中有效复制,诱导产生针对外来抗原的局部和全身免疫反应。NDV的基因组较大,可以很好地容纳外源基因。作为RNA病毒,与宿主细胞发生DNA重组的可能性较小。由于宿主范围的限制,人群中没有预先存在的NDV抗体,NDV对人类来说相对安全。因此,NDV作为一种疫苗载体颇受关注。论文简要论述了NDV的生物学特征,外源基因的插入方式,重点阐述了重组新城疫病毒载体疫苗的研究进展,以期为设计其他有效的兽用和人用活载体疫苗提供参考。

关键词：新城疫病毒新城疫病毒载体重组病毒载体疫苗

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新城疫病毒载体疫苗研究进展

广东畜牧兽医科技 2023年第2期48卷 18-23页

作者：张国丽徐少珠邝贞结潘成稚肖杰齐冬梅广东永顺生物制药股份有限公司广东广州511356

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)作为载体已成功地应用于多种人类和动物疫病疫苗的研发中。大量研究表明,重组新城疫病毒(Recombinant NDV,rNDV)载体疫苗相较于传统疫苗无论在体液免疫、黏膜免疫,还是攻毒保护等方面均有较好... 详细信息

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)作为载体已成功地应用于多种人类和动物疫病疫苗的研发中。大量研究表明,重组新城疫病毒(Recombinant NDV,rNDV)载体疫苗相较于传统疫苗无论在体液免疫、黏膜免疫,还是攻毒保护等方面均有较好的表现。NDV载体已成为研制安全、高效、低毒、免疫原性更佳的载体疫苗的重要工具。该文综述了利用NDV作为疫苗载体的反向遗传学技术在家禽、哺乳动物和人用新型疫苗研制方面的进展,以期为更好地利用NDV载体研制更多的疫苗提供新的思路。

关键词：反向遗传学技术新城疫病毒载体疫苗

天蚕素AD抗菌肽在新城疫病毒载体系统中的表达及抑菌效果研究

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天蚕素AD抗菌肽在新城疫病毒载体系统中的表达及抑菌效果研究

作者：任项霏华中农业大学

学位级别：硕士

人类对抗生素的依赖导致其被滥用,最终导致产生大量的耐药菌甚至超级耐药菌。抗菌肽具有独特的作用机制不易使细菌产生耐药性,因此,抗菌肽有望成为最佳的抗生素替代品。天蚕素抗菌多肽(Cecropin)是最早被发现且杀菌/抑菌效果较好的抗菌... 详细信息

人类对抗生素的依赖导致其被滥用,最终导致产生大量的耐药菌甚至超级耐药菌。抗菌肽具有独特的作用机制不易使细菌产生耐药性,因此,抗菌肽有望成为最佳的抗生素替代品。天蚕素抗菌多肽(Cecropin)是最早被发现且杀菌/抑菌效果较好的抗菌肽,天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)就是其中一种。因人工合成的成本昂贵,所以急需合适的表达系统来表达CAD抗菌多肽,使其可以广泛用于细菌病的治疗。本研究构建并拯救了表达CAD的新城疫载体活病毒疫苗候选株,通过免疫宿主在其体内持续产生CAD抗菌多肽,作用于感染部位并杀死细菌,从而起到治疗细菌病的目的。本课题的主要研究内容和结果如下:1、重组新城疫病毒全长质粒的构建及病毒拯救采用In-Fusion同源重组的方式将CAD和CAD基因片段分别插入至NDV TS09-C株载体的P和M基因之间的非编码区中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出两种重组新城疫病毒r TS-CAD和r TS-CAD。重组病毒r TS-CAD能在SPF鸡胚中稳定增殖,但重组病毒r TS-CAD在传至第5代时发生CAD拷贝数缺失现象,不能稳定传代。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入CAD和CAD基因并不会改变亲本株的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组新城疫病毒能在BHK-21细胞中成功表达抗菌肽CAD和CAD。2、重组新城疫病毒表达的天蚕素AD对细菌的抑制作用本研究采用生长曲线法、微孔板法和DF-1细胞共培养3种方法来验证重组病毒表达的CAD抗菌肽在体外对细菌的抑制作用。利用生长曲线法测定时发现,重组病毒组均在第2-4 h内抑菌效果最好,分别可将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)的存活率降低至47.0%-57.0%和9.9%-18.8%。微孔板法抑菌试验中,重组病毒组对***的抑制率分别为79.6%-91.7%和79.7%-93.7%;对大肠杆菌(Escherichia coli,***)的抑制率分别为87.5%-89.8%和79.7%-87.5%。与DF-1细胞共培养实验中,重组病毒组对***的抑制率分别可达到74.5%-77.7%和30.0%-68.0%;对***的抑制率分别为35.0%-45.0%和8.0%-45.0%。综上可知,NDV载体系统表达的CAD和CAD在体外对***(ATCC 29213)(G+)和***(ATCC 25922)(G-)均有一定的抑制作用,且对***的抑制效果更好。另外,利用不同试验方法测得r TS-CAD和r TS-CAD组的体外抑菌率无显著差异。为了证明重组病毒表达的CAD抗菌肽在体内的抑菌活性,建立小鼠伤口感染***的动物模型,再经皮下注射r TS-CAD和r TS-CAD两种重组病毒至伤口皮肤周围。接种后第7 d发现伤口处***数量与对照组相比显著减少(P病毒表达的CAD抗菌多肽可以在小鼠体内对***表现出较强的抑制作用,且r TS-CAD组抑制效果优于r TS-CAD组,同时也促进了小鼠伤口的快速愈合。3、鸡肺部和肠道菌群多样性分析本研究中,2周龄的SPF雏鸡分别接种r TS-CAD和r TS-CAD,7d-21d的NDV抗体水平与NDV载体对照组相比并没有显著提高。对鸡肺部菌群进行16S测序后发现,主要是由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及放线菌门四大菌门组成。经样本群落结构分析可知,重组病毒组的鸡肺部菌群丰富度均提高。此外,通过Kruskal Wallis算法分析筛选出几种差异显著的菌群,如肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌等。分析结果发现,重组病毒组能够显著抑制肠杆菌和拟杆菌等致病菌,并且提高乳酸菌和双歧杆菌等益生菌的菌群丰度;表达CAD的重组病毒对肠杆菌等致病菌的抑制程度显著高于r TS-CAD组(P病毒组的菌群丰度略高于TS09-C对照组。数据分析发现,重组病毒两组鸡肠道内的拟杆菌、瘤胃球菌等厌氧菌菌群丰度均显著低于TS09-C对照组(P<0.1),且r TS-CAD组显著低于r TS-CAD组(P<0.01),乳酸菌和芽孢杆菌等有益菌均显著高于TS09-C对照组(P<0.05),且r TS-CAD组显著高于

关键词：天蚕素AD 新城疫病毒载体反向遗传操作系统抗菌肽菌群丰度

新城疫载体系统表达天蚕素AD抗菌肽及其抑菌效果

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中国兽医学报 2023年第9期43卷 1820-1827页

作者：任项霏冯贺龙徐英英李丽杨宏春王鑫商雨阳柳君周祖涛李自力刘梅罗青平胡思顺温国元华中农业大学动物科学技术学院/动物医学院湖北武汉430070 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430064 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室湖北武汉430064 畜禽病原微生物学湖北省重点实验室湖北武汉430064 湖北洪山实验室湖北武汉430070 湖北省预防兽医学重点实验室湖北武汉430070

为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚... 详细信息

为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚中稳定增殖。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入CAD基因并未改变其的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组病毒能在BHK-21细胞中稳定表达CAD抗菌肽。抑菌试验结果显示,NDV载体系统表达的CAD对金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)均有一定的抑制作用:在微孔板法抑菌试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率为79.6%~91.7%,对大肠杆菌的抑制率为87.5%~89.8%;在与DF-1细胞共培养试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率可以达到74.5%~77.7%,对大肠杆菌的抑制率为35.0%~45.0%。本研究表明,NDV载体系统能够成功表达出有活性的CAD抗菌肽,且有良好的抑菌效果。这一研究为探索NDV载体表达抗菌肽和进一步研究CAD的局部效应奠定了一定的理论基础。

关键词：天蚕素AD 新城疫病毒载体反向遗传操作系统抗菌肽

表达鸡传染性喉气管炎病毒gB、gD、gI蛋白耐热重组新城疫病毒的构建与评价

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表达鸡传染性喉气管炎病毒gB、gD、gI蛋白耐热重组新城疫病毒的构...

作者：孟晨晨扬州大学

学位级别：硕士

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectiouslaryngotracheitisvirus,ILTV）引起的以鸡呼吸困难、气喘、咳出带血粘液及产蛋下降为特征的重要传染病,给家禽生产带来较大经济损失。以新城... 详细信息

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectiouslaryngotracheitisvirus,ILTV）引起的以鸡呼吸困难、气喘、咳出带血粘液及产蛋下降为特征的重要传染病,给家禽生产带来较大经济损失。以新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）为载体构建基因工程重组疫苗是生产上预防ILT的重要方法之一,但传统NDV弱毒株存在不耐热、不利于保存运输等缺点,因此构建新型耐热NDV基因工程重组载体疫苗毒株具有重要意义。本实验室前期分离鉴定到一株耐热的NDV强毒株NDV/HR09,在此基础上构建了一株热稳定的新型嵌合病毒NDV/cHR-DT-CI,其F基因被替换为基因Ⅶ型毒株的F基因,并将F蛋白裂解位点序列突变为112ERQER↓L117（属于NDV Class I）。本研究以该NDV耐热弱毒株为母本病毒,利用反向遗传技术构建表达ILTV gB、gD和gI蛋白的3株重组疫苗候选株,并对其生物学特性进行鉴定,为ILT疫苗研发提供重要的技术基础。1.耐热新城疫病毒外源基因表达载体的构建本研究利用NDV/cHR-DT-CI反向遗传技术平台,在分析病毒全基因组序列的基础上,将Pme Ⅰ酶切位点引入NDV基因组P和M基因间的非编码区,构建含Pme Ⅰ酶切位点的NDV全基因组转录载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI;将构建的转录载体与3个辅助质粒（pCI-NP、pCI-P和pCI-L）共转染BSR细胞,进行病毒拯救及鉴定。结果显示,接种转染细胞及上清的SPF鸡胚尿囊液血凝结果为阳性,表明含PmeⅠ酶切位点的表达载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI构建成功。为验证载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI是否能够用于外源基因的表达,本研究将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Flurescent Protion,EGFP）基因通过无缝克隆技术重组到NDV表达载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI的Pme Ⅰ酶切位点,构建含EGFP基因和NDV全基因的转录载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-EGFP。经病毒拯救,在转染48h后,在荧光倒置显微镜下可以观察到绿色荧光,说明重组病毒构建成功,将获救的重组病毒命名为 NDV/rAHR09-Ⅶ-EGFP。为探究重组病毒的生物学特性,首先将重组病毒NDV/rAHR09-Ⅶ-EGFP在鸡胚上连续传20代,对不同代次重组病毒中的EGFP基因进行PCR扩增。结果显示,各代次重组病毒均能鉴定到EGFP基因,且测序结果正确,说明重组病毒具有较好的遗传稳定性;利用Western Blot方法对重组病毒中的EGFP进行鉴定,结果表明构建的重组病毒能够正常表达EGFP。然后,为探究外源基因的插入是否会影响重组病毒的耐热性能,将重组病毒置于 56℃分别处理 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 和 60 min,血凝结果显示耐热处理后重组病毒的血凝效价能够一直保持在8log2,证明重组病毒具有良好的热稳定性;最后,本研究对重组病毒对鸡胚的感染能力和毒力进行评价。结果显示该重组病毒对鸡胚的感染能力为108EID50/0.2mL,MDT值为148h,符合NDV弱毒株特征,证明外源EGFP基因的插入对NDV的毒力不产生影响。以上结果表明,本研究成功构建了一种含PmeⅠ插入位点的NDV表达载体,该载体能够成功表达外源基因。同时,外源基因的插入不影响重组病毒的耐热性和毒力。2.表达ILTV gB、gD和gI蛋白耐热重组新城疫病毒的构建以构建的表达载体pNDV/rAHR09-Ⅶ-PI为基础,在Pme Ⅰ酶切位点处分别插入ILTV的gB、gD和gI基因,构建表达ILTV gB、gD和gI蛋白的耐热重组新城疫病毒。经病毒拯救,将成功获救的3株病毒命名为NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gB、NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gD 和 NDV/rAHR09-Ⅶ/ILTV-gI。以制作的 gB、gD 和 gI 蛋白多克隆抗体为一抗,对3株重组病毒外源蛋白表达进行Western Blot鉴定,结果显示3株重组病毒均能表达外源蛋白。为评价3株重组病毒的遗传稳定性,首先将3株重组病毒在SPF鸡胚上连续传20代,分别收集0代、5代、15代和20代的病毒尿囊液进行gB、gD和gI基因扩增鉴定,结果均能鉴定到对应的外源基因,且基因序列正确,表明外源基因均能在构建NDV重组病毒中稳定遗传。随后,对3株重组病毒进行耐热性的评价,选择HA效价相同的重组病毒于56℃分别处理10min、20min、30min、40min、50min和60min,结果发现3株重组病毒在处理60 min后HA效价仍不低于6log2,而相同处理条件下

关键词：传染性喉气管炎病毒新城疫病毒载体热稳定性 ILTV抗原蛋白

表达鸡传染性喉气管炎病毒gB蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫效力的评估

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表达鸡传染性喉气管炎病毒gB蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫效...

作者：贺言武汉轻工大学

学位级别：硕士

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的一种禽类急性呼吸道疾病,典型的临床症状为精神沉郁、呼吸困难、眼睑肿胀、咯出带血粘液等。当前防控该病... 详细信息

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的一种禽类急性呼吸道疾病,典型的临床症状为精神沉郁、呼吸困难、眼睑肿胀、咯出带血粘液等。当前防控该病的主要方式是疫苗接种,以弱毒疫苗为主,然而其存在毒力返强的风险,所以新型ILTV疫苗的研制极为重要。gB蛋白是ILTV的主要保护性抗原。本研究利用反向遗传操作技术将ILTV gB基因插入到新城疫病毒耐热株(TS09-C株)中,获得重组新城疫病毒r TS-gB,测定了其生物学特性和评估了其免疫效力;同时建立了配套的ILTV抗体间接ELISA检测方法。具体研究内容和结果如下:1.表达鸡传染性喉气管炎gB基因的重组新城疫病毒的构建及其免疫保护实验通过PCR方法扩增获得ILTV WG株的gB基因,并将其插入到NDV TS09-C株基因组P和M基因之间,拯救获得重组病毒r TS-gB。间接免疫荧光和Western-Blot结果显示gB蛋白可以在重组病毒感染的细胞内表达。重组病毒的最小致死剂量的平均致死时间(MDT)大于168小时;1日龄SPF雏鸡的脑内致病指数(ICPI)为0;56℃热稳定性实验表明r TS-gB与TS09-C株的热稳定性相近;表明重组病毒r TS-gB保持了亲本TS09-C株的弱毒、耐热的生物学特性。为了评价重组病毒r TS-gB的免疫效果,进行1月龄SPF鸡免疫实验。免疫后14天,r TS-gB免疫的鸡的NDV抗体血凝抑制效价大于4 log,且间接ELISA方法检测的ILTV抗体阳性率达100%(与商品苗免疫效果一致)。免疫14天后用ILTV WG强毒株进行攻毒试验,观察临床发病症状,结果显示,r TS-gB试验组保护率与商品化弱毒疫苗对照一样均达到100%,未免疫组全部发病且有两只鸡死亡。以上结果表明表达鸡传染性喉气管炎gB基因的重组新城疫病毒r TS-gB可作为防控ILT和ND的二联疫苗候选株。2.间接ELISA检测传染性喉气管炎病毒抗体方法的建立利用大肠杆菌表达系统,表达和纯化ILTV gB截短片段gB2(aa327-665)。以纯化的ILTV gB2蛋白为包被抗原,对反应条件进行优化,建立了间接ELISA检测ILTV抗体的方法。该方法对禽流感病毒、禽白血病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽大肠杆菌和沙门氏菌阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性好。用该方法和商品化的ILTV抗体ELISA检测试剂盒进行了临床样品检测,两种方法的符合率达94%。以上结果表明ILTV抗体的间接ELISA方法建立成功,其可以作为本研究中和临床上检测ILTV抗体的方法。综上所述,本研究构建了鸡传染性喉气管炎gB基因重组新城疫病毒r TS-gB,该重组病毒具亲本株相似的特性,并能诱导鸡产生较高水平的NDV和ILTV抗体,ILTV攻毒保护率为100%,保护效果与商品疫苗相近;此外建立了ILTV gB蛋白的间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,与商品化的ELISA试剂盒有较高检测符合率,为ILTV防控提供技术支撑。

关键词：鸡传染性喉气管炎新城疫病毒载体重组疫苗间接ELISA