表达鸡传染性喉气管炎病毒gB蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫效力的评估

作     者：贺言 

作者单位：武汉轻工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾驰;温国元

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸡传染性喉气管炎 新城疫病毒载体 重组疫苗 间接ELISA 

摘      要：鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的一种禽类急性呼吸道疾病,典型的临床症状为精神沉郁、呼吸困难、眼睑肿胀、咯出带血粘液等。当前防控该病的主要方式是疫苗接种,以弱毒疫苗为主,然而其存在毒力返强的风险,所以新型ILTV疫苗的研制极为重要。gB蛋白是ILTV的主要保护性抗原。本研究利用反向遗传操作技术将ILTV gB基因插入到新城疫病毒耐热株(TS09-C株)中,获得重组新城疫病毒r TS-gB,测定了其生物学特性和评估了其免疫效力;同时建立了配套的ILTV抗体间接ELISA检测方法。具体研究内容和结果如下:1.表达鸡传染性喉气管炎gB基因的重组新城疫病毒的构建及其免疫保护实验通过PCR方法扩增获得ILTV WG株的gB基因,并将其插入到NDV TS09-C株基因组P和M基因之间,拯救获得重组病毒r TS-gB。间接免疫荧光和Western-Blot结果显示gB蛋白可以在重组病毒感染的细胞内表达。重组病毒的最小致死剂量的平均致死时间(MDT)大于168小时;1日龄SPF雏鸡的脑内致病指数(ICPI)为0;56℃热稳定性实验表明r TS-gB与TS09-C株的热稳定性相近;表明重组病毒r TS-gB保持了亲本TS09-C株的弱毒、耐热的生物学特性。为了评价重组病毒r TS-gB的免疫效果,进行1月龄SPF鸡免疫实验。免疫后14天,r TS-gB免疫的鸡的NDV抗体血凝抑制效价大于4 log,且间接ELISA方法检测的ILTV抗体阳性率达100%(与商品苗免疫效果一致)。免疫14天后用ILTV WG强毒株进行攻毒试验,观察临床发病症状,结果显示,r TS-gB试验组保护率与商品化弱毒疫苗对照一样均达到100%,未免疫组全部发病且有两只鸡死亡。以上结果表明表达鸡传染性喉气管炎gB基因的重组新城疫病毒r TS-gB可作为防控ILT和ND的二联疫苗候选株。2.间接ELISA检测传染性喉气管炎病毒抗体方法的建立利用大肠杆菌表达系统,表达和纯化ILTV gB截短片段gB2(aa327-665)。以纯化的ILTV gB2蛋白为包被抗原,对反应条件进行优化,建立了间接ELISA检测ILTV抗体的方法。该方法对禽流感病毒、禽白血病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽大肠杆菌和沙门氏菌阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性好。用该方法和商品化的ILTV抗体ELISA检测试剂盒进行了临床样品检测,两种方法的符合率达94%。以上结果表明ILTV抗体的间接ELISA方法建立成功,其可以作为本研究中和临床上检测ILTV抗体的方法。综上所述,本研究构建了鸡传染性喉气管炎gB基因重组新城疫病毒r TS-gB,该重组病毒具亲本株相似的特性,并能诱导鸡产生较高水平的NDV和ILTV抗体,ILTV攻毒保护率为100%,保护效果与商品疫苗相近;此外建立了ILTV gB蛋白的间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,与商品化的ELISA试剂盒有较高检测符合率,为ILTV防控提供技术支撑。