天蚕素AD抗菌肽在新城疫病毒载体系统中的表达及抑菌效果研究

作     者：任项霏 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡思顺;温国元

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：天蚕素AD 新城疫病毒载体 反向遗传操作系统 抗菌肽 菌群丰度 

摘      要：人类对抗生素的依赖导致其被滥用,最终导致产生大量的耐药菌甚至超级耐药菌。抗菌肽具有独特的作用机制不易使细菌产生耐药性,因此,抗菌肽有望成为最佳的抗生素替代品。天蚕素抗菌多肽(Cecropin)是最早被发现且杀菌/抑菌效果较好的抗菌肽,天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)就是其中一种。因人工合成的成本昂贵,所以急需合适的表达系统来表达CAD抗菌多肽,使其可以广泛用于细菌病的治疗。本研究构建并拯救了表达CAD的新城疫载体活病毒疫苗候选株,通过免疫宿主在其体内持续产生CAD抗菌多肽,作用于感染部位并杀死细菌,从而起到治疗细菌病的目的。本课题的主要研究内容和结果如下:1、重组新城疫病毒全长质粒的构建及病毒拯救采用In-Fusion同源重组的方式将CAD和CAD基因片段分别插入至NDV TS09-C株载体的P和M基因之间的非编码区中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出两种重组新城疫病毒r TS-CAD和r TS-CAD。重组病毒r TS-CAD能在SPF鸡胚中稳定增殖,但重组病毒r TS-CAD在传至第5代时发生CAD拷贝数缺失现象,不能稳定传代。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入CAD和CAD基因并不会改变亲本株的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组新城疫病毒能在BHK-21细胞中成功表达抗菌肽CAD和CAD。2、重组新城疫病毒表达的天蚕素AD对细菌的抑制作用本研究采用生长曲线法、微孔板法和DF-1细胞共培养3种方法来验证重组病毒表达的CAD抗菌肽在体外对细菌的抑制作用。利用生长曲线法测定时发现,重组病毒组均在第2-4 h内抑菌效果最好,分别可将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)的存活率降低至47.0%-57.0%和9.9%-18.8%。微孔板法抑菌试验中,重组病毒组对***的抑制率分别为79.6%-91.7%和79.7%-93.7%;对大肠杆菌(Escherichia coli,***)的抑制率分别为87.5%-89.8%和79.7%-87.5%。与DF-1细胞共培养实验中,重组病毒组对***的抑制率分别可达到74.5%-77.7%和30.0%-68.0%;对***的抑制率分别为35.0%-45.0%和8.0%-45.0%。综上可知,NDV载体系统表达的CAD和CAD在体外对***(ATCC 29213)(G+)和***(ATCC 25922)(G-)均有一定的抑制作用,且对***的抑制效果更好。另外,利用不同试验方法测得r TS-CAD和r TS-CAD组的体外抑菌率无显著差异。为了证明重组病毒表达的CAD抗菌肽在体内的抑菌活性,建立小鼠伤口感染***的动物模型,再经皮下注射r TS-CAD和r TS-CAD两种重组病毒至伤口皮肤周围。接种后第7 d发现伤口处***数量与对照组相比显著减少(P0.01),且r TS-CAD组菌落数显著少于r TS-CAD组(P0.01);伤口大小明显缩小;伤口处皮肤病理切片显示r TS-CAD和r TS-CAD两组的皮肤组织的表皮局部增厚,皮下可见大量结缔组织增生以及大量新生的毛细血管,逐渐进入愈合四期,而对照组的皮肤结构不清,部分皮肤坏死,愈合缓慢。综上证明,重组病毒表达的CAD抗菌多肽可以在小鼠体内对***表现出较强的抑制作用,且r TS-CAD组抑制效果优于r TS-CAD组,同时也促进了小鼠伤口的快速愈合。3、鸡肺部和肠道菌群多样性分析本研究中,2周龄的SPF雏鸡分别接种r TS-CAD和r TS-CAD,7d-21d的NDV抗体水平与NDV载体对照组相比并没有显著提高。对鸡肺部菌群进行16S测序后发现,主要是由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及放线菌门四大菌门组成。经样本群落结构分析可知,重组病毒组的鸡肺部菌群丰富度均提高。此外,通过Kruskal Wallis算法分析筛选出几种差异显著的菌群,如肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌等。分析结果发现,重组病毒组能够显著抑制肠杆菌和拟杆菌等致病菌,并且提高乳酸菌和双歧杆菌等益生菌的菌群丰度;表达CAD的重组病毒对肠杆菌等致病菌的抑制程度显著高于r TS-CAD组(P0.01)。对鸡盲肠内容物进行测序后发现,不同实验组的肠道菌群在门水平上的菌群丰度存在一定的差异,其中重组病毒组的菌群丰度略高于TS09-C对照组。数据分析发现,重组病毒两组鸡肠道内的拟杆菌、瘤胃球菌等厌氧菌菌群丰度均显著低于TS09-C对照组(P0.1),且r TS-CAD组显著低于r TS-CAD组(P0.01),乳酸菌和芽孢杆菌等有益菌均显著高于TS09-C对照组(P0.05),且r TS-CAD组显著高于