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新型鹅细小病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

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中国家禽 2024年

作者：梁国洋毛明田郭华李芳张帅唐熠刁有祥山东农业大学动物科技学院动物医学院青岛易邦生物工程有限公司

为快速高效地检测新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV），试验根据NGPV VP3基因序列设计特异性引物及探针，以NGPV KC3S3株提取的DNA为模板，在构建质粒标准品的基础上，建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方... 详细信息

为快速高效地检测新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV），试验根据NGPV VP3基因序列设计特异性引物及探针，以NGPV KC3S3株提取的DNA为模板，在构建质粒标准品的基础上，建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方法的标准曲线为y=-3.081 6x+35.389，相关系数（R2）为0.998 1，质粒标准品浓度为1.0×102～1.0×108 copies/μL时具有良好的线性关系；该方法对禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、星状病毒（Astrovirus,AstV）、小鹅瘟病毒（Goose parvovirus,GPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）、新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）、禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAV）等鸭常见病毒性病原均无特异性扩增；所设计引物及探针的基因序列与GPV及MDPV的相同区域有4～11个碱基发生突变，可以避免GPV及MDPV对检测结果的影响；该方法批内和批间检测变异系数（CV）均小于1.5%，对66份疑似感染NGPV鸭的肝脏样品检测阳性率为59.1%，高于常规PCR检测结果（31.8%）。结果表明，研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可以有效区分GPV与MDPV，在NGPV感染的临床诊断和早期防控方面具有良好的应用前景。

关键词：新型鹅细小病毒 TaqMan探针荧光定量PCR 鸭

新型鹅细小病毒徐州分离株NGPV XZ-01的分离和致病性研究

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畜牧与兽医 2024年第2期56卷 82-88页

作者：迟兰蔺辉星徐州生物工程职业技术学院江苏徐州221006 南京农业大学江苏南京210095

为了研究2021年6月江苏徐州某商品半番鸭养殖场所发疾病的病原及其致病性,从该养殖场发病的半番鸭群中无菌采集肝脏、脾脏、肠道等临床样品,采用PCR方法对病原进行鉴定,将所采集样本处理后接种至非免疫鸭胚中,连续多次传代后,对鸭胚组... 详细信息

为了研究2021年6月江苏徐州某商品半番鸭养殖场所发疾病的病原及其致病性,从该养殖场发病的半番鸭群中无菌采集肝脏、脾脏、肠道等临床样品,采用PCR方法对病原进行鉴定,将所采集样本处理后接种至非免疫鸭胚中,连续多次传代后,对鸭胚组织及尿囊液进行病理学、电镜检查及动物试验。结果显示:PCR检测结果鉴定为新型鹅细小病毒阳性;鸭胚尿囊液在电镜下观察到细小病毒粒子,胚体病理切片观察显示符合细小病毒所致病变;动物试验显示,攻毒试验鸭主要表现为生长发育明显受阻,大部分试验鸭成为“僵鸭”,于20日龄后陆续出现上下喙变短、舌头外露等症状,剖检病变主要为肠内容物稀薄及泄殖腔膨大,肠道组织切片观察显示肠绒毛上皮细胞坏死、脱落及部分肠腺坏死,符合鸭短喙侏儒综合征(short beak and dwarfism syndrome,SBDS)所致雏鸭的症状与病变。结果表明:该肉鸭养殖场所发疾病为SBDS,将该场分离的病毒命名为新型鹅细小病毒徐州分离株(NGPV XZ-01株)。

关键词：鸭短喙侏儒综合征新型鹅细小病毒徐州分离株分离鉴定动物试验

山东、广西地区新型鹅细小病毒全基因组扩增及遗传进化分析

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中国家禽 2024年第6期46卷 44-55页

作者：乔丹丹刘婷隽陈全刚李德宝周婕董淑红胡安康徐州医科大学实验动物中心江苏徐州221004 徐州生物工程职业技术学院动物工程学院江苏徐州221006

为监测新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的流行和变异情况,研究采集了山东和广西部分地区的鸭短喙综合征病料进行病原检测、全基因组扩增及序列比对分析。结果显示:共分离两株NGPV,山东分离株命名为SD202304,广西分离株命名... 详细信息

为监测新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的流行和变异情况,研究采集了山东和广西部分地区的鸭短喙综合征病料进行病原检测、全基因组扩增及序列比对分析。结果显示:共分离两株NGPV,山东分离株命名为SD202304,广西分离株命名为GX202304,两株病毒与2021年NGPV分离株HNXY21亲缘关系最近,全基因组序列相似性为99.1%;GX202304株末端重复序列(Inverted terminal repeat,ITR)有一段未见报道的51 bp基因插入;VP3编码氨基酸序列比对显示,在第290位GX202304株和SD202304株有一个苏氨酸到丙氨酸的突变,这是NGPV近年来发生的新变异位点。研究表明,从山东、广西地区分离到的两株NGPV存在51 bp新的基因插入片段和VP3新的突变位点,结果为我国NGPV感染的防控提供科学依据。

关键词：新型鹅细小病毒全基因组序列鸭变异

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新型鹅细小病毒病诊断及其综合防治措施

山东畜牧兽医 2024年第2期45卷 72-75页

作者：乔丹丹刘婷隽陈全刚胡安康徐州医科大学实验动物中心江苏徐州221004

由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)引起的鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)可导致鸭的“大舌病”,常出现胫骨骨折、生长发育受阻、体重减轻等症状,给我国养鸭业造成严重的经济损失。NGPV主要感... 详细信息

由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)引起的鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)可导致鸭的“大舌病”,常出现胫骨骨折、生长发育受阻、体重减轻等症状,给我国养鸭业造成严重的经济损失。NGPV主要感染樱桃谷鸭、北京鸭、番鸭和半番鸭等。本文就NGPV病的病因分析、流行病特点、临床症状和免疫防控进行综述,以期为该病的防治提供参考依据。

关键词：新型鹅细小病毒短喙与侏儒综合征诊断防治

新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2023年第9期53卷 1145-1151页

作者：刘琳敏田甜郝雪飘庞洪泽雷白时赵款张武超袁万哲河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒(NGPV) VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制... 详细信息

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒(NGPV) VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,NGPV VP2基因全长为2 199 bp;通过大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出大小约为83 ku的His-VP2融合蛋白。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别受感染细胞中的NGPV和鹅细小病毒。综上所述,本研究成功表达并纯化了VP2蛋白,并成功制备了效价高反应性好的多克隆抗体,为进一步探究NGPV VP2蛋白生物学功能奠定了基础。

关键词：鸭短喙与侏儒综合征新型鹅细小病毒多克隆抗体 VP2

新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核可溶性表达及优化

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中国兽医科学 2023年第10期53卷 1285-1291页

作者：向凤君刘琳敏雷白时杨颖郭笑然路文斌田甜张武超赵款袁万哲河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术创新中心农业农村部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站

本研究利用基因工程技术将VP2编码基因克隆至载体pET-32a(+)中,成功构建重组质粒pET-32a-VP2,通过表达条件摸索发现VP2为包涵体表达。为了实现VP2蛋白的可溶性表达,制备含有能表达分子伴侣蛋白groES-groEL-tig的质粒pG-Tf2和重组质粒pET... 详细信息

本研究利用基因工程技术将VP2编码基因克隆至载体pET-32a(+)中,成功构建重组质粒pET-32a-VP2,通过表达条件摸索发现VP2为包涵体表达。为了实现VP2蛋白的可溶性表达,制备含有能表达分子伴侣蛋白groES-groEL-tig的质粒pG-Tf2和重组质粒pET-32a-VP2双质粒表达系统。通过对双质粒表达系统表达条件的探索,发现在IPTG为0.25 mmol/L、四环素碱为250μg/L、诱导时间12 h、诱导温度20℃时可溶性表达效果最佳,可溶性蛋白占总表达量80%。经过Western-blot分析,证实重组蛋白具有良好反应原性。结果表明,利用分子伴侣与NGPV VP2蛋白的共表达系统,实现了新型鹅细小病毒(NGPV)VP2在大肠杆菌中的可溶性表达,为检测方法的建立和亚单位疫苗的研发奠定基础。

关键词：新型鹅细小病毒分子伴侣可溶性表达原核表达

新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析

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畜牧兽医学报 2022年第2期53卷 654-657页

作者：王璐瑶郝雪飘雷白时赵款张武超袁万哲河北农业大学动物医学院保定071001 河北省兽医生物技术创新中心保定071001

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸... 详细信息

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸腺上调基因有111个,下调基因有78个;感染组肝中上调基因有128个,下调基因有313个;NGPV感染雏鸭后,胸腺、回肠和肝中的差异表达基因参与免疫效应过程、淋巴细胞介导的免疫等多个免疫相关生物学过程,并在Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号等多条信号通路富集。综上表明:NGPV感染激活了机体免疫反应和宿主细胞的相关抗病毒信号通路。此研究为NGPV的致病机制研究提供了新的线索。

关键词：新型鹅细小病毒短喙侏儒综合征转录组测序免疫反应

新型鹅细小病毒GDZQ297株对雏番鸭的致病性研究

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中国动物传染病学报 2023年

作者：魏无缺黄惠兰陆泳锟刘梦凡陈作鑫赵梓桥许芬芬梅堃黄淑坚佛山科学技术学院梅州市平远县农业农村局广东省华晟生物技术有限公司

广东肇庆某养殖场22日龄樱桃谷鸭表现短嘴、腹泻和生长停滞，为进一步明确病因，将病鸭的肝脏和脾脏组织经无菌处理后，接种9日龄樱桃谷鸭胚连续传代培养，分离获得1株病毒，命名为GDZQ297，第5代次病毒滴度达102ELD50/0.2mL。经PCR鉴... 详细信息

广东肇庆某养殖场22日龄樱桃谷鸭表现短嘴、腹泻和生长停滞，为进一步明确病因，将病鸭的肝脏和脾脏组织经无菌处理后，接种9日龄樱桃谷鸭胚连续传代培养，分离获得1株病毒，命名为GDZQ297，第5代次病毒滴度达102ELD50/0.2mL。经PCR鉴定和基因遗传演化分析，发现GDZQ297株与HN1P株(MK737642)同属一个分支，为新型鹅细小病毒(NGPV)。为探究新型鹅细小病毒对雏番鸭的易感性和致病力，本研究以GDZQ297分离株(2.7 lgELD50/只)人工感染1日龄雏番鸭(MDPV、GPV抗体检测为阴性)，攻毒后观察20天，重点关注雏鸭感染后发病情况、排毒动态以及多个组织脏器病毒载量变化。结果显示，20天攻毒期内感染GDZQ297株雏番鸭，临床症状主要表现为发育迟缓、腹泻、喙萎缩、舌外伸和腿骨变短，耐过鸭的体重约为正常鸭的74%，攻毒期间内未出现死亡(30/30)。病理解剖主要呈现出感染鸭的口腔、泄殖腔以及多个组织脏器可检测出的病毒载量均为103拷贝/μL以上，心脏和脾脏在感染后14 d达到107拷贝/μL以上。本研究为新型鹅细小病毒诊断和检测提供参考。

关键词：新型鹅细小病毒雏番鸭致病性

新型鹅细小病毒信阳株的全基因组扩增及遗传进化分析

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畜牧与兽医 2023年第1期55卷 112-119页

作者：焦凤超张鑫李迎晓雷震曲哲会董建国赵瑜何书海李洵黄立赵聘信阳农林学院/河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心河南信阳464000

为了解信阳地区新型鹅细小病毒(NGPV)的遗传变异特性,对疑似NGPV感染麻鸭病例进行病原检测,采集肝脏和脾脏无菌处理后接种SPF鸭胚,成功分离到1株NGPV,命名为HNXY21株,并对其进行全基因组序列分析和VP1基因重组鉴定。序列比对和系统发育... 详细信息

为了解信阳地区新型鹅细小病毒(NGPV)的遗传变异特性,对疑似NGPV感染麻鸭病例进行病原检测,采集肝脏和脾脏无菌处理后接种SPF鸭胚,成功分离到1株NGPV,命名为HNXY21株,并对其进行全基因组序列分析和VP1基因重组鉴定。序列比对和系统发育树表明,分离株HNXY21和其他9株NGPV同处于鹅细小病毒(GPV)组内的一个独立分支上,与山东分离株SD0316(GenBank登录号:MN415969)核苷酸同源性最高;VP1蛋白的氨基酸序列分析显示,与经典GPV和番鸭细小病毒(MDPV)相比,有8个氨基酸位点突变;通过Simplot软件对VP1基因进行重组分析表明,分离株HNXY21 VP1基因存在重组信号,其潜在的主要亲本为山东分离株SD0316和弱毒疫苗株SYG61v。本研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料,为进一步研究NGPV的致病机制奠定了基础。

关键词：新型鹅细小病毒遗传变异重组