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斯氏假单胞菌A1501 EPSP合酶基因的克隆及表达

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斯氏假单胞菌A1501 EPSP合酶基因的克隆及表达

作者：沙纪莹四川师范大学

学位级别：硕士

植物和微生物芳香族氨基酸生物合成过程中的一个关键酶——5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP synthase;EC2.***.1.19)由aroA基因编码,该酶受广谱灭生性、内吸传导型除草剂草甘膦的竞争性抑制,将EPSP合成酶基因转入植物中可获得草甘膦... 详细信息

植物和微生物芳香族氨基酸生物合成过程中的一个关键酶——5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP synthase;EC2.***.1.19)由aroA基因编码,该酶受广谱灭生性、内吸传导型除草剂草甘膦的竞争性抑制,将EPSP合成酶基因转入植物中可获得草甘膦耐受植株。本论文就当前我国抗除草剂作物基因工程中存在的“草甘膦抗性功能基因缺乏”这一主要问题,开展了对高抗草甘膦菌株及其EPSPS的研究,主要的研究成果如下:从斯氏假单胞菌A1501基因组文库中克隆到一个完整的基因,能恢复EPSP合酶缺陷型菌株*** AKM4188在限制性培养基中的生长能力,并能在草甘膦浓度为150mmol/L的M9液体培养基中良好生长。T-Coffee系统发育分析表明A1501 EPSPS属于II型EPSPS且具有与草甘膦抗性相关和维持PEP绑定相关的重要区域,该基因有望成为培育高抗草甘膦转基因作物的基因材料。

关键词： 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶草甘膦抗性斯氏假单胞菌

斯氏假单胞菌S12过氧化氢酶基因的克隆表达及其酶学性质的研究

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斯氏假单胞菌S12过氧化氢酶基因的克隆表达及其酶学性质的研究

作者：赵书雪河北农业大学

学位级别：硕士

过氧化氢酶可以催化过氧化氢分解产生水和氧气,过氧化氢酶在食品行业中已经得到普遍应用,如食品防腐、食品的消毒、无菌包装、还有对动物食品进行漂白和脱色等。但是现在商品化食品过氧化氢酶来源比较单一,主要是从动物肝脏中分离纯化... 详细信息

过氧化氢酶可以催化过氧化氢分解产生水和氧气,过氧化氢酶在食品行业中已经得到普遍应用,如食品防腐、食品的消毒、无菌包装、还有对动物食品进行漂白和脱色等。但是现在商品化食品过氧化氢酶来源比较单一,主要是从动物肝脏中分离纯化、黑曲霉通风搅拌等条件下培养得到的。而且目前食品级过氧化氢酶的酶活力较低,热稳定较差,不能满足某些工业生产的需要。因此,本研究拟筛选具有高过氧化氢酶活性的菌株,对其过氧化氢酶基因进行了体外表达研究,通过理性设计和正交设计的方法对过氧化氢酶进行了多点突变,成功提高了酶比活和热稳定性。主要结果如下:1、从垃圾渗滤液中筛选出具有高过氧化氢酶活性的三株菌株,并对具有较高过氧化氢酶酶活表达的一株菌株进行全基因组测序,经16s rDNA鉴定该菌株是斯氏假单胞菌,并将其命名为Pseudomonasstutzeri S12。2、本研究首次对斯氏假单胞菌的过氧化氢酶KatE进行体外研究,发现该过氧化氢酶的最适温度是35℃,且在10～40℃的范围内都具有较高的酶比活,当温度超过40℃时,酶活迅速下降,因此该酶属于能够适应低温环境的中温酶,这为以后该酶在冷藏海鲜等食品保藏方面的应用提供了研究思路。3、过氧化氢酶KatE的最适pH是8.0,且在碱性条件下较稳定。1mmol/L Na+、Mg2+对该酶的活性有一定的促进作用,酶活分别提高2%,6%;Li+、K+、Ba2+对该酶的活性抑制作用不明显,Zn2+、Mn2+、Ca2+、Al3+对酶活有部分抑制作用;Ni2+、Cu2+、Co2+对酶的抑制作用最强,酶活均下降了 99%。因此在实际生产应用中在过氧化氢酶的反应体系中加入适量的Na+、Mg2+有助于提高过氧化氢酶的酶比活。4、本研究使用共识蛋白设计,对于与KatE相似的5274条序列进行分析,选择9个突变位点,并结合正交设计,仅仅通过1 1个多位点突变体就得到了这9个突变位点及其交互作用对过氧化氢酶活力和热稳定性的影响的结果。从中筛选出来可能提高过氧化氢酶KatE的酶比活和热稳定性的4个突变位点。经过对这四个位点进行分析,发现单点突变Y112F的酶比活的热稳定性较好,双点突变Y112F和S204N结合突变体、F135I和T387S结合突变体的酶比活和热稳定较好,Tm值分别是(45.46±0.06)℃、(45.70±0.05)℃,其中 F135I 和 T387S 结合突变体的酶比活和热稳定性最好,分别提高了 7%和18%。因此通过正交实验和理性设计的方法提高蛋白酶的活力和热稳定性是一条可以参考的方法。本研究从垃圾渗滤液中筛选出具有过氧化氢酶活性的斯氏假单胞菌,并对其过氧化氢酶基因的酶学性质进行分析研究,通过正交实验和理性设计的方法提高了过氧化氢酶的酶比活和热稳定性,丰富了对斯氏假单胞菌的基因研究,为低温过氧化氢酶的研究奠定了基础,并为食品过氧化氢酶的生产与应用提供了新的道路。

关键词：斯氏假单胞菌过氧化氢酶理性设计热稳定性

固氮斯氏假单胞菌dctB基因在大肠杆菌中异源表达的研究

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核农学报 2008年第2期22卷 165-168,164页

作者：李红权平淑珍何升陈明林敏河北大学生命科学学院河北保定071002 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

固氮斯氏假单胞菌dctB基因编码一个二元调控系统的感应蛋白DctB,该蛋白可以感应环境中四碳二羧酸的存在,通过磷酸化激活转录因子DctD,启动四碳二羧酸转运结构基因的转录,为生物固氮过程提供能量。本研究通过克隆dctB基因并实现了其在大... 详细信息

固氮斯氏假单胞菌dctB基因编码一个二元调控系统的感应蛋白DctB,该蛋白可以感应环境中四碳二羧酸的存在,通过磷酸化激活转录因子DctD,启动四碳二羧酸转运结构基因的转录,为生物固氮过程提供能量。本研究通过克隆dctB基因并实现了其在大肠杆菌BL21(DE3)中的过量表达,经IPTG诱导8h后DctB的表达量达到最高。该研究为进一步纯化DctB蛋白,深入研究该蛋白的功能与性质奠定了基础。

关键词：斯氏假单胞菌 dctB 蛋白表达

比较基因组分析斯氏假单胞菌遗传多样性及固氮基因岛进化机制

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江苏农业科学 2017年第1期45卷 33-38页

作者：李向阳汤宏张国辉凯里学院环境与生命科学学院贵州凯里556011 复旦大学环境科学与工程系上海杨浦200433

对5株固氮与11株非固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组开展综合比较分析,从基因组水平上研究斯氏假单胞菌种内遗传多样性及其固氮基因岛进化机制。核心与元基因组分析发现,16个斯氏假单胞菌拥有的独特基因数占元基因数的46.3... 详细信息

对5株固氮与11株非固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组开展综合比较分析,从基因组水平上研究斯氏假单胞菌种内遗传多样性及其固氮基因岛进化机制。核心与元基因组分析发现,16个斯氏假单胞菌拥有的独特基因数占元基因数的46.37%;基于平均核苷酸相似度分析,这16个菌株被划分为11种不同的基因组变异型,表明斯氏假单胞菌基因组异质化程度高。固氮基因岛及进化树分析表明,5株固氮菌属于3种不同基因组变异型,它们的固氮基因岛及其侧翼序列保守性好,而且固氮酶基因进化树与菌株谱系进化树呈现高度一致性。据此推测,斯氏假单胞菌祖先可能通过水平基因转移的方式获得固氮基因岛,从而转变为固氮菌,但是在后期进化过程中,绝大部分固氮菌株丢失了固氮基因岛。

关键词：斯氏假单胞菌固氮基因岛比较基因组基因组变异型多样性

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斯氏假单胞菌败血症一例报告

医学研究杂志 1996年第4期30卷 27-28页

作者：丁奇龙包头钢铁公司职工医院内一科

斯氏假单胞菌引起的败血症临床罕见。最近我院经血培养证实一例,并经北京协和医院鉴定确认。报告如下: 患者,男性,22岁,美国人。1994年11月到我国任教。1995年6月10日因发热3天入院。从6月7日始,无明显诱因出现畏寒,发热伴头痛、全身不... 详细信息

斯氏假单胞菌引起的败血症临床罕见。最近我院经血培养证实一例,并经北京协和医院鉴定确认。报告如下: 患者,男性,22岁,美国人。1994年11月到我国任教。1995年6月10日因发热3天入院。从6月7日始,无明显诱因出现畏寒,发热伴头痛、全身不适。发热第一日排稀水便3次,,此后自行停止。

关键词：斯氏假单胞菌败血症血培养发热美国人全身不适协和医院报告非发酵菌患者

斯氏假单胞菌F1M对草鱼养殖水体水质和菌群结构的影响

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