斯氏假单胞菌S12过氧化氢酶基因的克隆表达及其酶学性质的研究

作     者：赵书雪 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：田健;郑晓卫

授予年度：2020年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：斯氏假单胞菌 过氧化氢酶 理性设计 热稳定性 

摘      要：过氧化氢酶可以催化过氧化氢分解产生水和氧气,过氧化氢酶在食品行业中已经得到普遍应用,如食品防腐、食品的消毒、无菌包装、还有对动物食品进行漂白和脱色等。但是现在商品化食品过氧化氢酶来源比较单一,主要是从动物肝脏中分离纯化、黑曲霉通风搅拌等条件下培养得到的。而且目前食品级过氧化氢酶的酶活力较低,热稳定较差,不能满足某些工业生产的需要。因此,本研究拟筛选具有高过氧化氢酶活性的菌株,对其过氧化氢酶基因进行了体外表达研究,通过理性设计和正交设计的方法对过氧化氢酶进行了多点突变,成功提高了酶比活和热稳定性。主要结果如下:1、从垃圾渗滤液中筛选出具有高过氧化氢酶活性的三株菌株,并对具有较高过氧化氢酶酶活表达的一株菌株进行全基因组测序,经16s rDNA鉴定该菌株是斯氏假单胞菌,并将其命名为Pseudomonasstutzeri S12。2、本研究首次对斯氏假单胞菌的过氧化氢酶KatE进行体外研究,发现该过氧化氢酶的最适温度是35℃,且在10～40℃的范围内都具有较高的酶比活,当温度超过40℃时,酶活迅速下降,因此该酶属于能够适应低温环境的中温酶,这为以后该酶在冷藏海鲜等食品保藏方面的应用提供了研究思路。3、过氧化氢酶KatE的最适pH是8.0,且在碱性条件下较稳定。1mmol/L Na+、Mg2+对该酶的活性有一定的促进作用,酶活分别提高2%,6%;Li+、K+、Ba2+对该酶的活性抑制作用不明显,Zn2+、Mn2+、Ca2+、Al3+对酶活有部分抑制作用;Ni2+、Cu2+、Co2+对酶的抑制作用最强,酶活均下降了 99%。因此在实际生产应用中在过氧化氢酶的反应体系中加入适量的Na+、Mg2+有助于提高过氧化氢酶的酶比活。4、本研究使用共识蛋白设计,对于与KatE相似的5274条序列进行分析,选择9个突变位点,并结合正交设计,仅仅通过1 1个多位点突变体就得到了这9个突变位点及其交互作用对过氧化氢酶活力和热稳定性的影响的结果。从中筛选出来可能提高过氧化氢酶KatE的酶比活和热稳定性的4个突变位点。经过对这四个位点进行分析,发现单点突变Y112F的酶比活的热稳定性较好,双点突变Y112F和S204N结合突变体、F135I和T387S结合突变体的酶比活和热稳定较好,Tm值分别是(45.46±0.06)℃、(45.70±0.05)℃,其中 F135I 和 T387S 结合突变体的酶比活和热稳定性最好,分别提高了 7%和18%。因此通过正交实验和理性设计的方法提高蛋白酶的活力和热稳定性是一条可以参考的方法。本研究从垃圾渗滤液中筛选出具有过氧化氢酶活性的斯氏假单胞菌,并对其过氧化氢酶基因的酶学性质进行分析研究,通过正交实验和理性设计的方法提高了过氧化氢酶的酶比活和热稳定性,丰富了对斯氏假单胞菌的基因研究,为低温过氧化氢酶的研究奠定了基础,并为食品过氧化氢酶的生产与应用提供了新的道路。