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牛冠状病毒恒温隔绝式荧光rt-pcr方法的建立与基因组研究

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牛冠状病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR方法的建立与基因组研究

作者：张琪西南民族大学

学位级别：硕士

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起犊牛腹泻的主要病原体,还导致成年牛冬痢和牛呼吸道疾病,是养牛业的一大难题。对BCoV的防控最重要的是及时对病原体进行检测,了解BCoV的感染情况。本研究的目的是建立检测BCoV的恒温隔绝式荧... 详细信息

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起犊牛腹泻的主要病原体,还导致成年牛冬痢和牛呼吸道疾病,是养牛业的一大难题。对BCoV的防控最重要的是及时对病原体进行检测,了解BCoV的感染情况。本研究的目的是建立检测BCoV的恒温隔绝式荧光rt-pcr方法,并应用该方法对国内部分地区BCoV进行分子检测和基因组研究,进一步了解国内BCoV的感染情况,丰富BCoV分子特征及基因组的数据,取得如下成果:1.成功建立了检测BCoV的恒温隔绝式荧光rt-pcr方法牛冠状病毒(Bovne Coronavirus BCoV)是引起牛腹泻和呼吸道疾病的重要病原,尽管目前基于pcr原理检测BCoV的方法较多,但未见有恒温隔绝式荧光rt-pcr(insulated isothermal rt-pcr,iirt-pcr)方法的报道,本研究对GenBank中的全部144条完整的BCoV N基因序列进行比对分析,在保守区域设计了一对特异性引物和探针,优化了最佳的反应体系,建立起了检测BCoV的iirt-pcr方法。该方法的特异性好,只能检出BCoV,不能检出其他无关病原;稳定性好,批内、批间的变异系数都小于5%;灵敏度高,检测下限是11copies·μL。利用该方法对犊牛腹泻样本和牛呼吸道样本中BCoV的检出率均明显高于国外报道的Taq Man荧光定量rt-pcr方法。可将检测每一个样品所需的各试剂按量分装后进行冻干保存,再配合POCKIT系列手持式核酸分析仪和Pet NAD核酸提取试剂盒使用,操作方便快速,为BCoV的现场检测提供了一个有效的新工具。2.国内4个省区牛冠状病毒的分子检测2019年11月至2020年12月,在国内4个省(四川、河南、内蒙古及宁夏回族自治区)的15个规模化养牛场共采集了177份患病牛样本(腹泻粪便和呼吸道分泌物):其中包括110份3月龄以内犊牛腹泻粪便样本(四川省1个场22份、河南省3个场9份、内蒙古1个场26份、宁夏8个场53份);49份成年牛冬痢疾样本(河南省2个场);18份犊牛呼吸道样本(来自上述同一个内蒙古牛场)。采用前期建立的检测BCoV的iirt-pcr方法来检测所有样本,结果表明,110份犊牛腹泻样本中BCoV的检出率为26.36%(29/110),场阳性率为81.82%(9/13);49份成年牛冬痢疾样本中BCoV的检出率为20.41%(10/49),18份犊牛呼吸道样本中BCoV的检出率为38.89%(7/18),这表明BCoV在采样牛场中广泛流行。成功从4个省6个牛场的16个(12个犊牛腹泻、1个成年牛冬痢疾及3个牛呼吸道)阳性样本中同时扩增出完整的S基因和HE基因,进化树结果显示,本研究克隆的S基因与国内的BCoV毒株遗传关系最近,显示出共同的进化趋势,将GenBank中所有的完整S基因进行氨基酸对比,我们发现了一条S基因在S1B区连续缺失了四个氨基酸。与Gen Bank中的全部195条完整BCoV HE基因相比,有14个与中国的29个毒株(1株来自于牦牛和28株来自奶牛)聚为独立一大支;一个与4个中国的奶牛毒株聚为一小支;还有一个与2个美国毒株聚在一小支上。重组分析软件结果显示,13条HE基因(13/16)发生了重组事件,重组区域位于HE酯酶和凝集素结构域之间,可能对HE的受体结合功能产生影响,这13条重组HE基因来自于4个省的5个牛场,并分布于犊牛腹泻样本、成年牛冬痢疾和牛呼吸道样本三种不同的临床样本中,这表明HE基因重组毒株没有组织特异性,这对于进一步了解BCoV的分子特征及遗传变异有重要的意义,为BCoV的防控提供重要的理论参考。3.牛冠状病毒的基因组研究为进一步研究BCoV S基因氨基酸缺失株的基因组特征,使用本实验室前期设计的44对引物,成功的扩增了BCoV SWUN/NMG-D10/2020株的全基因组序列,并分析其特征。结果表明,该毒株完整基因组全长为31008 bp,G+C%的含量为37.05%。该SWUN/NMG-D10/2020株与GenBank中3个中国的奶牛源BCoV遗传关系最近,核苷酸同源性为99.0%-99.2%。该毒株的ORF1a和ORF1b基因也与这3个中国的奶牛源BCoV遗传关系最近。该毒株的HE基因与11个中国奶牛毒株乙酰酯酶域(E)中有1个独特的氨基酸突变(T121I)区别于其他,该区域的氨基酸突变可能影响受体破坏功能。与GenBank中的255条BCoV完整的S基因进行氨基酸序列分析,在S1B区受体结合域的541-544位点连续缺失了12个核苷酸导致4个氨基酸的缺失(SKST)。该区域的缺失可能改变病毒与受体的结合能力,从而改变其致病性及组织嗜性,这是首次在国内BCoV的S基因中发现氨基酸缺失事件,这丰富了BCoV的遗传进化数据库。

关键词：牛冠状病毒恒温隔绝式荧光rt-pcr 基因组 S基因

BVDV1型恒温隔绝式荧光rt-pcr检测试剂盒的研制及应用

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BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测试剂盒的研制及应用

作者：周军西南民族大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性感染的重要病原,给全球养牛业造成了巨大的损失。pcr检测技术是目前检测BVDV的主流手段。尽管目前已建立的BV... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性感染的重要病原,给全球养牛业造成了巨大的损失。pcr检测技术是目前检测BVDV的主流手段。尽管目前已建立的BVDV pcr检测方法很多,但未见适用于临床现场检测BVDV的pcr检测方法及试剂盒,制约了BVDV的快速诊断和检疫。本研究的目的是基于恒温隔绝式荧光rt-pcr(Insulated isothermal rt-pcr,ii rt-pcr)技术,研制检测BVDV1型的试剂盒,并应用试剂盒进行BVDV1型现场诊断及流行病学调查。并取得了以下成果:***1型恒温隔绝式荧光rt-pcr检测试剂盒研制及应用为了研制能现场检测BVDV1型的荧光rt-pcr检测试剂盒,对GenBank中下载的54条BVDV1型、43条BVDV2型、11条BVDV3型5’UTR序列进行分析后,设计了特异性检测BVDV1型的引物:BVDV1 iiF:5’-AAGCC-TCGAGATGCCACG-3’,BVDV1 iiR:5’-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3’;探针:BVDV1 iiPb:5’-FAM-CCCACAGCACATC-TTAA-MGB-3’。通过体系优化,建立了BVDV1型恒温隔绝式荧光rt-pcr检测方法。该方法稳定性好、特异性好,对BVDV1型参考毒株、BVDV1a、BVDV1b、BVDV1c、BVDV1d均能检出,对无关病原未检出;检测下限为52.7 copies·μL,灵敏度高。与SNT1905-2007推荐的rt-pcr方法和两种文献报道的荧光定量rt-pcr方法同时对60份腹泻粪便样本和60份血清样本进行BVDV1型的检测,结果表明本方法均优于其他三种方法。将该方法优化的反应体系试剂进行定量分装、冻干处理后与阳性质粒模板、回溶Buffer共同组装成为50μL体系检测试剂盒,可满足一个50μL体系或两个25μL体系的使用,减少了加样的环节,节约了反应时间,减少了操作过程中的污染,并具有可常温保存和运输的优势。配合PetNAD核酸提取试剂盒和POCKIT?手持式核酸分析仪,实现了BVDV1型的现场诊断,从核酸提取到出检测结果仅需1 h。采用本实验研制的BVDV1型iirt-pcr检测试剂盒对阿坝藏族羌族自治州若尔盖县热尔乡和红原县安曲镇两个牧场爆发以腹泻为特征的疾病进行现场检测诊断,均检出有BVDV1型的感染;对来自于我国9个省/市区的29份商品化牛冻精样本和2016017年来自4个品牌的20份胎牛血清样本进行检测,其BVDV1型的检出率分别为34.48%和75%,表明四川省市场流通的商品化牛冻精和胎牛血清中BVDV1型的携带率较高。2.川西北草原牦牛BVDV的病原流行病学调查川西北草原是我国牦牛养殖的主要区域之一,犊牛腹泻是该区域的常见病和多发病。为了调查川西北草原牦牛腹泻样本和麦洼牦牛核心种群中BVDV1型的流行情况,采集了2015017年川西北草原25个牧场的448份牦牛腹泻样本和麦洼牦牛核心种群3个牧场的627份血清样本,采用研制的BVDV1型iirt-pcr检测试剂盒进行BVDV1型病原流行病学调查,及BVDV1型与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的混合感染情况调查。调查结果显示:2015017年牦牛腹泻样本中BVDV1型平均检出率为29.01%;2015年、2016年、2017年的BVDV1型检出率分别为27.47%、30%、29.11%。对检出的130份BVDV1型阳性样本进行BRV、BCoV的混合感染情况的调查,结果显示BVDV1型与BRV、BCoV的混合感染率分别90%、75.38%。本实验结果表明川西北草原BVDV1型、BRV、BCoV的混感染情况严重,为川西北草原牦牛腹泻病的防控提供了科学依据。

关键词：牦牛牛病毒性腹泻病毒1型恒温隔绝式荧光rt-pcr 检测试剂盒病原流行病学

牦牛源轮状病毒的分离鉴定及其荧光rt-pcr检测方法的建立与应用

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牦牛源轮状病毒的分离鉴定及其荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

作者：李凡西南民族大学

学位级别：硕士

轮状病毒(Rotavirus,RV)是牦牛腹泻的主要病原,造成的经济损失巨大。作为RV的主要分子检测靶点的VP6基因在牦牛源RV上出现了变异,导致现有的检测牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV)的rt-pcr方法对牦牛源RV的检测时结果不理想,严重制约了... 详细信息

轮状病毒(Rotavirus,RV)是牦牛腹泻的主要病原,造成的经济损失巨大。作为RV的主要分子检测靶点的VP6基因在牦牛源RV上出现了变异,导致现有的检测牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV)的rt-pcr方法对牦牛源RV的检测时结果不理想,严重制约了该病的防控。本研究的目的是对牦牛源RV阳性样本进行病毒的分离鉴定,并研制基于恒温隔绝式荧光rt-pcr(Insulated isothermal rt-pcr,iirt-pcr)技术的检测试剂盒用于现场检测牦牛源RV,同时建立荧光定量rt-pcr方法用于牦牛源RV的病原流行病学调查。取得如下成果:1.牦牛源轮状病毒的分离鉴定采用MA-104细胞对检测确定的牦牛阳性样本进行轮状病毒的分离。共分离培养得到10个毒株,其中5株的样本来源于云南香格里拉地区,5株的样本来源于青海玉树地区,均已传代培养至第10代,其中一株在盲传6代后出现细胞病变。收集该细胞毒株的每一代细胞培养物,经rt-pcr鉴定并测序证实RV的存在,使用间接免疫荧光法也证实该分离病毒为RV。本结果为进一步的牦牛源RV的病原学及疫苗研究奠定了物质基础。2.基于恒温隔绝式rt-pcr技术现场检测牦牛源轮状病毒的试剂盒的研制与应用青藏高原地广人稀,交通不便。为了实现牦牛源RV的现场检测,在分析BRV和牦牛源RV VP6基因序列后,设计合成引物和探针,通过优化反应体系,配合商品化PetNAD核酸萃取试剂盒,建立了基于iirt-pcr技术现场检测BRV和牦牛源RV的方法。该方法只对BRV和牦牛源RV检出,对牛冠状病毒、牛星状病毒、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、牛大肠杆菌、牛沙门氏菌、牛艾美尔球虫、牛瑞氏隐孢子虫等无关病原不检出;检测下限为96.6 copies·μL,重复性好;与现有的检出方法的比较结果表明,本方法明显优于与文献报道的检测BRV和牦牛源RV的方法;本研究建立的iirt-pcr方法特异性好、灵敏度高、重复性好,既可用于牦牛源RV的检测,又可用于BRV检测;从核酸提取到报告检测结果仅需1 h,操作方便,可现场使用,在此基础上将试剂进行分装冻干处理后与PetNAD试剂配合组装成为检测试剂盒,为牦牛RV的现场快速诊断提供有力的工具。3.川西北草原牦牛源轮状病毒的病原流行病学调查为了满足牦牛源RV的流行病学调查对检测方法的高通量需求,采用本实验设计的引物建立了用于检测牦牛源RV的基于SYBR的荧光定量rt-pcr方法。结果表明,该方法在熔解温度Tm=78.75℃±0.15℃出现单一的特异性峰,无引物二聚体,检测无关病原时无荧光信号,表明其特异性强;检出下限为23.9copies·μL,灵敏度高;该方法有良好的线性关系,相关系数为0.9981,扩增效率为95.6%,组内变异系数为0.01%.08%,组间变异系数为0.02%.06%,重复性好。本方法对牦牛源RV的检出率明显优于文献报道的检测BRV的荧光定量rt-pcr方法和检测牦牛源RV的rt-pcr方法,为牦牛源RV的流行病学调查及定量检测提供了可靠的手段。采用该方法对2016年川西北草原14个牧场的88份牦牛腹泻病料的病原流行病学调查显示,牦牛源RV感染率高达98.86%,表明牦牛源RV感染是当前该地区牦牛腹泻的重要原因,为该地区牦牛腹泻病的防控提供了可靠的科学依据。

关键词：牦牛轮状病毒分离培养 VP6基因恒温隔绝式荧光rt-pcr 荧光定量rt-pcr

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牦牛源环曲病毒的检测及其基因组研究

牦牛源环曲病毒的检测及其基因组研究

作者：赵龙西南民族大学

学位级别：硕士

牛环曲病毒(Bovine torovirus,BToV)为单股正链RNA病毒,属于托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)环曲病毒属(Torovirus)。BToV是一种重要的牛腹泻病原,可引起各年龄阶段的牛腹泻,给世界养牛业造成了较大的经济损失,该病毒还具有呼吸道组织嗜... 详细信息

牛环曲病毒(Bovine torovirus,BToV)为单股正链RNA病毒,属于托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)环曲病毒属(Torovirus)。BToV是一种重要的牛腹泻病原,可引起各年龄阶段的牛腹泻,给世界养牛业造成了较大的经济损失,该病毒还具有呼吸道组织嗜性,可能也是一种呼吸道致病因子。牦牛是青藏高原牧民最重要的生活物质资料,犊牛腹泻是牦牛常见病和多发病,给牦牛养殖业造成了巨大的经济损失。本实验室前期已在国内奶牛中检出BToV,但在牦牛中的流行情况未见报道。本研究旨在建立检测BToV的恒温隔绝式荧光rt-pcr(Insulated isothermal rt-pcr,rt-iipcr)方法,并调查BToV在牦牛中的流行情况及基因组特征。取得成果如下:1.成功建立了检测BToV的恒温隔绝式荧光rt-pcr方法,并证实了BToV在牦牛中的存在本研究前期采用国外引用最多的巢式rt-pcr方法对宏病毒组技术检测为BToV阳性的牦牛腹泻粪便样本进行复检,BToV检出率较低,分析发现检测靶点序列已经发生变异,有必要重新建立检测BToV的rt-pcr方法。选择GenBank中现有的13条完整M基因序列和2条牦牛源BToV M基因片段(巢式rt-pcr方法获得)进行比对分析,利用Beacon Designer 8设计引物和探针,通过优化反应条件和体系,建立了检测BToV的rt-iipcr方法。该方法具有良好的特异性和稳定性,只特异性检出BToV,而对BVDV、BRV、BEV、BCoV、BAstV、牛源大肠杆菌K99等病原均不检出,最低检测限为23.2 copies.μL,对临床样本的检测结果与国外报道的实时荧光定量rt-pcr方法一致并且优于巢式rt-pcr方法。利用本研究建立的rt-iipcr方法对2018年5月至2020年9月从青藏高原3省22个牧场采集的共180份犊牦牛腹泻样本进行BToV检测,BToV平均阳性率约为7.8%(14/180)。其中,西藏、青海、四川藏区的阳性率分别约为11.8%(4/34)、8.9%(4/45)、5.9%(6/101),场阳性率为31.8%(7/22)。本研究成功建立了检测BToV的rt-iipcr方法,为BToV的快速检测提供了新的工具;首次证实了BToV在牦牛中的存在,丰富了牦牛腹泻病原谱,虽然阳性率不高,但是具有广泛的地域分布,为牦牛腹泻防控提供了参考。2.成功获得了第一条牦牛源BToV基因组为进一步研究牦牛源BToV的分子特征,根据GenBank中现有的5条完整BToV基因组序列设计27对引物,扩增阳性粪便样本中BToV基因组,并使用SEQMAN软件组装基因组。成功从西藏犊牦牛粪便样本中扩增拼接得到一个牦牛源BToV基因组,命名为BToV yak-XZ01,该基因组属于基因Ⅲ型,长度为28314bp,G+C%含量为36.31%。BToV yak-XZ01与GenBank数据库中现有的5个BToV基因组的核苷酸相似性为82%～97%,与国内奶牛源BToV基因组SC2的核苷酸相似性最高(97%)。基于基因组、ORF1a/1b、S、HE、N基因的系统发育分析显示,BToV yak-XZ01与国内奶牛源BToV亲缘关系最近,表明牦牛源BToV可能是由国内奶牛源BToV传播而来,但也具有一定的遗传距离。与GenBank中现有的5个BToV聚合蛋白pp1ab相比,BToV yak-XZ01聚合蛋白pp1ab存在21个独特的氨基酸突变,主要集中在类木瓜蛋白酶结构域(9/21)和Rd Rp聚合酶结构域(5/21),类木瓜蛋白酶和Rd Rp聚合酶在病毒的复制过程中起着关键作用,这些突变可能会影响病毒的复制。BToV yak-XZ01基因组S蛋白S1亚基鉴定出区域重组事件,并且与GenBank中现有BToV序列相比,HE蛋白酯酶结构域内还存在1个独特的氨基酸突变(P44S),S1亚基和HE蛋白酯酶结构域均参与病毒与受体结合过程,这些变异可能会影响病毒的受体结合功能。本研究首次获得了牦牛源基因Ⅲ型BToV基因组,丰富了BToV的基因组数据;首次报道了环曲病毒属成员的S基因重组事件,有助于进一步了解BToV的分子特征和遗传进化。

关键词：牦牛牛环曲病毒恒温隔绝式荧光rt-pcr 基因组 S基因重组