牦牛源轮状病毒的分离鉴定及其荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

作     者：李凡 

作者单位：西南民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汤承

授予年度：2017年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牦牛 轮状病毒 分离培养 VP6基因 恒温隔绝式荧光RT-PCR 荧光定量RT-PCR 

摘      要：轮状病毒(Rotavirus,RV)是牦牛腹泻的主要病原,造成的经济损失巨大。作为RV的主要分子检测靶点的VP6基因在牦牛源RV上出现了变异,导致现有的检测牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV)的RT-PCR方法对牦牛源RV的检测时结果不理想,严重制约了该病的防控。本研究的目的是对牦牛源RV阳性样本进行病毒的分离鉴定,并研制基于恒温隔绝式荧光RT-PCR(Insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术的检测试剂盒用于现场检测牦牛源RV,同时建立荧光定量RT-PCR方法用于牦牛源RV的病原流行病学调查。取得如下成果:1.牦牛源轮状病毒的分离鉴定采用MA-104细胞对检测确定的牦牛阳性样本进行轮状病毒的分离。共分离培养得到10个毒株,其中5株的样本来源于云南香格里拉地区,5株的样本来源于青海玉树地区,均已传代培养至第10代,其中一株在盲传6代后出现细胞病变。收集该细胞毒株的每一代细胞培养物,经RT-PCR鉴定并测序证实RV的存在,使用间接免疫荧光法也证实该分离病毒为RV。本结果为进一步的牦牛源RV的病原学及疫苗研究奠定了物质基础。2.基于恒温隔绝式RT-PCR技术现场检测牦牛源轮状病毒的试剂盒的研制与应用青藏高原地广人稀,交通不便。为了实现牦牛源RV的现场检测,在分析BRV和牦牛源RV VP6基因序列后,设计合成引物和探针,通过优化反应体系,配合商品化PetNAD核酸萃取试剂盒,建立了基于iiRT-PCR技术现场检测BRV和牦牛源RV的方法。该方法只对BRV和牦牛源RV检出,对牛冠状病毒、牛星状病毒、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、牛大肠杆菌、牛沙门氏菌、牛艾美尔球虫、牛瑞氏隐孢子虫等无关病原不检出;检测下限为96.6 copies·μL,重复性好;与现有的检出方法的比较结果表明,本方法明显优于与文献报道的检测BRV和牦牛源RV的方法;本研究建立的iiRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,既可用于牦牛源RV的检测,又可用于BRV检测;从核酸提取到报告检测结果仅需1 h,操作方便,可现场使用,在此基础上将试剂进行分装冻干处理后与PetNAD试剂配合组装成为检测试剂盒,为牦牛RV的现场快速诊断提供有力的工具。3.川西北草原牦牛源轮状病毒的病原流行病学调查为了满足牦牛源RV的流行病学调查对检测方法的高通量需求,采用本实验设计的引物建立了用于检测牦牛源RV的基于SYBR的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法在熔解温度Tm=78.75℃±0.15℃出现单一的特异性峰,无引物二聚体,检测无关病原时无荧光信号,表明其特异性强;检出下限为23.9copies·μL,灵敏度高;该方法有良好的线性关系,相关系数为0.9981,扩增效率为95.6%,组内变异系数为0.01%.08%,组间变异系数为0.02%.06%,重复性好。本方法对牦牛源RV的检出率明显优于文献报道的检测BRV的荧光定量RT-PCR方法和检测牦牛源RV的RT-PCR方法,为牦牛源RV的流行病学调查及定量检测提供了可靠的手段。采用该方法对2016年川西北草原14个牧场的88份牦牛腹泻病料的病原流行病学调查显示,牦牛源RV感染率高达98.86%,表明牦牛源RV感染是当前该地区牦牛腹泻的重要原因,为该地区牦牛腹泻病的防控提供了可靠的科学依据。