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猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量rt-pcr检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 162-168页

作者：柳佳佳梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥边孟婷黄书田红利潘向英贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量rt-pcr检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标... 详细信息

根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量rt-pcr检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规rt-pcr(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量rt-pcr方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。

关键词：猪轮状病毒 TaqMan探针荧光定量rt-pcr

马病毒性动脉炎病毒荧光定量rt-pcr检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2024年第2期46卷 159-163页

作者：梁歆歆王科珂蒋刚强徐军陈凯云王艳肖媛媛白梅花刘东石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 乌鲁木齐海关技术中心新疆乌鲁木齐830063 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心上海200120 喀什海关技术中心新疆喀什844099

为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量rt-pcr检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量rt-pcr方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的... 详细信息

为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量rt-pcr检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量rt-pcr方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量rt-pcr方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量rt-pcr方法和文献发表的EAV荧光定量rt-pcr方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量rt-pcr检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。

关键词：马病毒性动脉炎 ORF7基因荧光定量rt-pcr

鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量rt-pcr检测方法的建立与应用

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中国家禽 2024年

作者：陈立功穆英丽张诚潘保革范乐乐魏忠华王学静刘聚祥河北农业大学农业农村部动物疫病病原生物学华北科学观测实验站河北省畜牧兽医研究所

为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量rt-pcr方法，试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针，采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度，在优化退火温度的... 详细信息

为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量rt-pcr方法，试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针，采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度，在优化退火温度的基础上，分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线，进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性，建立的方法用于临床样品的检测，并与文献报道的常规rt-pcr方法进行比较。结果显示：优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40（或0.50）μmol/L，探针浓度均为0.50μmol/L，扩增线性范围分别为3.26×10～3～3.26×10～8拷贝/μL和7.09×10～3～7.09×10～8拷贝/μL，相关系数均为0.998；该方法可特异性检出两种GAstV，但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号；其检测限分别为3.26×10～2拷贝/μL和7.09×10～1拷贝/μL；组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量rt-pcr方法对临床样品的检测结果显示，GAstV阳性率为90.57%(96/10～6)；而文献报道的常规rt-pcr方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明，建立的TaqMan荧光定量rt-pcr检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。

关键词：鹅星状病毒荧光定量rt-pcr TaqMan探针

蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量rt-pcr检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2024年第3期 72-78页

作者：张体银王武军林素洁张志灯李宋钰于师宇福州海关技术中心福建省检验检疫技术研究重点实验室

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法，本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，建立了荧光定量rt-pcr检测方法。结果显示，以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量pcr方法，标准曲... 详细信息

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法，本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针，建立了荧光定量rt-pcr检测方法。结果显示，以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量pcr方法，标准曲线具有良好的线性关系，线性相关系数达0.998；该方法最低检出限为10拷贝/μL，与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应，具有良好的灵敏性和特异性；组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%，具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量rt-pcr检测方法，可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

关键词：蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量rt-pcr RNA依赖RNA聚合酶

传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量rt-pcr检测方法的建立

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广东畜牧兽医科技 2024年第3期49卷 54-59,82页

作者：曹雪珍周庆丰王连想严专强林丽苗李薇李群辉仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510640 温氏食品集团股份有限公司/广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室广东云浮527400

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序... 详细信息

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量rt-pcr检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量rt-pcr结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规rt-pcr的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量rt-pcr检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

关键词：传染性法氏囊病病毒新型变异株荧光定量rt-pcr Taq Man探针

猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒多重荧光定量rt-pcr检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2022年第11期44卷 1189-1195页

作者：刘影闫若潜杨海波王淑娟赵雪丽谢彩华柴茂王东方河南省动物疫病预防控制中心河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室河南郑州450008

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)的多重荧光定量rt-pcr方法,本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针,经各反应条件优化... 详细信息

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)的多重荧光定量rt-pcr方法,本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针,经各反应条件优化后,建立了检测PEDV、PDCoV、SADS-CoV的多重荧光定量rt-pcr方法。特异性试验结果显示,该方法仅对PEDV、PDCoV、SADS-CoV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等的核酸检测均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组质粒标准品的检测下限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,且在10^(1)拷贝/μL~10^(6)拷贝/μL范围内各重组质粒均与各自的Ct值有良好的线性关系。重复性试验结果显示,批内、批间重复性试验的变异系数均在0.33%~2.53%,重复性和稳定性均较好。利用建立的多重荧光定量rt-pcr方法对采自河南各地的100份临床样品进行检测,并与3种病毒的单一rt-pcr检测方法、相应病毒的标准检测方法(由于SADS-CoV无标准检测方法,则采用rt-pcr扩增后测序并经NCBI BLAST比较分析测序结果)进行比较分析,以评估本实验建立检测方法的临床应用效果。多重荧光定量rt-pcr结果显示,PEDV、PDCoV、SADS-CoV的阳性率分别为38%(38/100)、14%(14/100)、5%(5/100),不存在混合感染现象,与PEDV、PDCoV标准检测方法的符合率为100%,且敏感性高于单一rt-pcr方法。本研究首次建立了一种特异、敏感、快速的多重荧光定量rt-pcr方法,可以用于PEDV、PDCoV、SADS-CoV的鉴别检测,为猪腹泻类疫病鉴别诊断及防控奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒猪δ冠状病毒猪急性腹泻综合征冠状病毒荧光定量rt-pcr 检测方法

基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量rt-pcr检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2023年第9期45卷 910-915,929页

作者：魏新宇王铭杜炳辰史智宾杨德成王靖飞东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量rt-pcr方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经... 详细信息

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量rt-pcr方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经pcr和测序鉴定。基于该质粒标准品,采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度,初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量rt-pcr检测方法,并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板,利用本实验建立的TaqMan荧光定量rt-pcr方法检测,结果显示,仅GETV为阳性,SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性,表明该方法特异性较强;分别以10倍倍比稀释(3.07×10^(-1)拷贝/μL~3.07×10^(8)拷贝/μL)的重组质粒标准品p ET29a-nsP3作为模板,利用本研究建立的方法和普通rt-pcr方法分别检测,结果显示,本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/μL,敏感性是普通rt-pcr的100倍,敏感性较高;分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的荧光定量rt-pcr进行组内与组间的重复性试验检测,结果显示,该方法的组内组间变异系数均小于2%,重复性较好。利用本实验建立的TaqMan荧光定量rt-pcr方法与普通rt-pcr方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,该TaqMan荧光定量rt-pcr方法对GETV检出率为95.24%(80/84),而普通rt-pcr对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV nsP3基因建立了TaqMan荧光定量rt-pcr检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为GETV的检测提供了有效工具。

关键词：盖他病毒荧光定量rt-pcr nsP3 检测方法

番茄褐色皱果病毒Taq Man荧光定量rt-pcr检测方法的建立及应用

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植物保护 2023年第6期49卷 185-193页

作者：李献锋于璇冯黎霞于翠丁钿徐强赵菊鹏马骏武目涛魏霜广州海关技术中心广州510623 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心上海200135 广州白云机场海关综合技术服务中心广州510470

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)Taq Man荧光定量rt-pcr方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和Taq Man探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R^(2)为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规rt-pcr的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的Taq Man荧光定量rt-pcr方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。

关键词：番茄褐色皱果病毒 RNA依赖的RNA聚合酶 Taq Man探针荧光定量rt-pcr 检测

牛嵴病毒TaqMan荧光定量rt-pcr检测方法的建立及应用

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福建农业学报 2023年第7期38卷 851-856页

作者：赵润涛特木尔巴根郭宇武娅楠王旭芬侯琳张贺赵洋张志丹周伟光内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018 内蒙古自治区动物疫病预防控制中心内蒙古呼和浩特010020

【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量rt-pcr检测方法... 详细信息

【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量rt-pcr检测方法,并对临床样品进行检测。【结果】该方法最佳上下游引物浓度均为300nmol·L^(-1),探针浓度为400 nmol·L^(-1),在1×10^(1)~1×10^(8)copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为103%;特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出牛嵴病毒;敏感性较高,对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)copies·μL^(-1),而普通rt-pcr对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(2)copies·μL^(-1);重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×10^(5)copies·μL^(-1),健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×10^(3)copies·μL^(-1)。【结论】建立的牛嵴病毒Taq Man荧光定量rt-pcr检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

关键词：牛嵴病毒荧光定量rt-pcr 犊牛腹泻特异性敏感性重复性