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抗CD19嵌合受体修饰的NK-92细胞的构建及其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤作用

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中国肿瘤生物治疗杂志 2018年第8期25卷 767-771页

作者：姜鑫朱双阅郑海丽刘秉宇浙江大学医学院附属儿童医院药剂科浙江杭州310052 杭州市第七人民医院中西医结合科浙江杭州310013 浙江医院心内科浙江杭州310007

目的:构建表达CD19的二代CAR-NK-92细胞系,探讨其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的特异性杀伤作用。方法:构建表达CD19-CAR基因的载体并包装慢病毒颗粒,感染NK-92细胞,流式细胞术检测感染率,并进一步分选阳性细胞,Western blotting检测CD... 详细信息

目的:构建表达CD19的二代CAR-NK-92细胞系,探讨其对CD19阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的特异性杀伤作用。方法:构建表达CD19-CAR基因的载体并包装慢病毒颗粒,感染NK-92细胞,流式细胞术检测感染率,并进一步分选阳性细胞,Western blotting检测CD19-CAR在NK-92细胞中的表达;以CD19阴性骨髓瘤细胞U-266、CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞ARH-77和HS-Sultan细胞为靶细胞,以CD19CAR-NK-92为效应细胞,流式细胞术检测细胞杀伤实验中存活肿瘤细胞的绝对数量并计算杀伤率。结果:成功构建慢病毒载体p LVX-CD19-CAR并包装病毒颗粒,感染NK-92细胞后CD19CAR-NK-92细胞纯度高于90%;Western blotting分析显示CD19-CAR已经成功表达在NK-92中。CD19CAR-NK-92对ARH-77[(70.10±1.86)%vs(1.95±0.63)%,P0.05)。结论:成功构建了表达CD19CAR的NK-92细胞系,其对CD19阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞有特异性杀伤作用。

关键词：非霍奇金淋巴瘤嵌合受体 CD19 NK-92 细胞毒性

油菜素内酯(BR)超敏感嵌合受体的构建和水稻转基因表达

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2004年第5期30卷 482-486页

作者：李大勇毛碧增李建明陈卫良何祖华浙江大学生物技术研究所浙江杭州310029 美国密歇根大学分子细胞和发育生物学系 mc48109

将油菜素内酯(brassinosteroids,BR)超敏感受体激酶基因Sud1与水稻抗病受体激酶基因Xa21经体外点突变后构建了带SUD1LRR-JM结构域与XA21激酶域(kinase)的合成受体(chimera)基因SNRG1,同时构建了SUD1LRR突变体对照受体基因SNRGmL和XA21kinase突变体对照受体基因SNRGmK.应用基因枪(particlebombardment)转化技术成功将SNRG1,SNRGmL和SNRGmK导入粳稻模式品种台北309的胚性愈伤组织中,并由此获得了再生植株和细胞株.经PCR、Northernblot分子检测和表型观察证实外源基因已经转入并整合到水稻基因组.防卫基因表达的结果表明SNRG1可能已在体内微量的BR作用下,激发了水稻的防卫反应.该结果为进一步研究XA21激酶的抗性激发奠定了基础.

关键词：油菜素内酯超敏感受体水稻XA21激酶嵌合受体水稻转基因

油菜素内酯（BR）超敏感嵌合受体的构建和水稻转基因表达

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油菜素内酯（BR）超敏感嵌合受体的构建和水稻转基因表达

作者：李大勇浙江大学

学位级别：硕士

在植物和动物中，受体激酶(receptor-like kinases，RLKs)介导了各种各样的细胞信号传导途径。在动物细胞中，酪氨酸受体激酶和丝氨酸／苏氨酸受体激酶的作用机理在许多报告中已被详细阐明：配体通过识别并结合细胞外受体的相应的功能... 详细信息

在植物和动物中，受体激酶(receptor-like kinases，RLKs)介导了各种各样的细胞信号传导途径。在动物细胞中，酪氨酸受体激酶和丝氨酸／苏氨酸受体激酶的作用机理在许多报告中已被详细阐明：配体通过识别并结合细胞外受体的相应的功能区，使受体发生双聚作用，引起受体的磷酸化，从而激发其下游的一系列信号的传导。然而，对于植物来说，有关RLKs的相应研究只在最近几年才有一些突破性的工作。虽然在植物的基因组里可以推测到许多植物受体激酶基因的阅读框，但这些受体是怎样进行信号传导还不是很清楚。在这些植物受体激酶中，最大的一类是富亮氨酸重复(leucine-rice repeats，LRRs)的受体激酶(LRR-RLKS)。在拟南芥中至少含有200多个编码这一类激酶的基因。这类LRR-RLKS参与了各种各样的生物途径，包括分生组织的生长调控，抗病性，激素信号传递，组织发育等。虽然在遗传学上已得到了一些证据，但从生物化学角度来证明配体的存在，尚存在许多困难。有一个比较清楚的体系是拟南芥CLAVATA1-CLAVATA3的互作，基于分子遗传和生物化学的证据，CLAVATA3(推测为含96个氨基酸的细胞外蛋白)被认为是LRR-RLK(CLAVATA1)的配体。此外，遗传学研究表明类固醇激素油菜素内酯(Brassinosteroids，BR)配体的受体(BRI1)也是一个LRR-RLK。所以，LRR-RLK可能是以蛋白质或者小分子作为配体的。为了知道BRI1是否在BR的识别过程中起到了直接的作用，并籍此构建一个人工抗病受体基因的激发和信号控制系统。He等把BRI1的LRR-JM结构域(domain)与Xa21的丝氨酸／苏氨酸激酶重组构建了一个嵌合受体的信号传导系统NRG1。当用油菜素内酯处理水稻细胞株时，这个嵌合受体可以引发与XA21相同的植物防卫反应，包括活性氧迸发，防卫基因的激发，细胞死亡等。这个系统有力证明了BRI1在BR的识别过程中的直接作用。而且这个系统将可以使我们构建新的抗病基因，并发现新的植物受体激酶的配体。为了构建一个更敏感的BR激发的信号传导系统，利用油菜素内酯(brassinosteroids,BR)超敏感受体激酶基因Sudl与经体外点突变的水稻抗病受体激酶2003年浙江大学硕士学位论文基因 XaZI构建了一个带 SUD LRR＊M结构域与 XAZI激酶域伙inase）的合成受体（chimera）基因SNRG］，同时构建了 SUDI LRR突变体对照受体基因MGmL和XAZIkinase突变体对照受体基因 SNRGmK。应用基因枪…article bombardment）转化技术成功将MGI，SNRGmL和 SNRGmK导入粳稻模式品种台北 309的胚性愈伤组织中，并由此获得了再生植株和细胞株。经 PCR、Northern blot分子检测和表型观察证实外源基因已经转入并整合到水稻基因组。防卫基因表达的结果表明 SNRG可能己在体内微量的BR作用下，激发了水稻的防卫反应。为进一步的 XAZI激酶的抗性激发研究奠定了基五出。

关键词：受体激酶油菜素内酯超敏感受体水稻XA21激酶嵌合受体水稻转基因

重组嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ζ全基因合成及其真核表达载体的构建

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军医进修学院学报 2010年第4期31卷 360-362页

作者：刘辉杨波刘天懿焦顺昌李瑾昱解放军总医院肿瘤科北京100853

目的通过合成嵌合受体anti-erbB2scFv-CD28-ζ的基因并建立其真核表达载体,为进一步研究增强NK细胞抗瘤活性创造条件。方法在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对目的基因密码子及RNA二级结构进行优化并在序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRI... 详细信息

目的通过合成嵌合受体anti-erbB2scFv-CD28-ζ的基因并建立其真核表达载体,为进一步研究增强NK细胞抗瘤活性创造条件。方法在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对目的基因密码子及RNA二级结构进行优化并在序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRI限制酶切位点,根据基因序列分析的结果化学合成长度为50～70bp的单链oligo,利用PCR将合成的oligo拼接成完整的序列,将合成好的序列装入PMD-18T载体并转染至感受态细胞DH5α,测序验证重组克隆中基因序列。完整的序列经HindⅢ和EcoRI酶切后连接至目的载体PCDNA3.1(+)中,并转染COS-7细胞。结果合成DNA片段长度为1803bp,经测序验证与目的基因嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ζ大小、序列一致。结论构建其真核表达载体PCDNA3.1(+)后转染COS-7细胞,实现了anti-erbB2 scFv-CD28-ζ基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达。

关键词：嵌合受体基因表达转染

几丁质识别受体与Xa21的嵌合基因对水稻真菌病害的抗性研究

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几丁质识别受体与Xa21的嵌合基因对水稻真菌病害的抗性研究

作者：曹玉鑫海南大学

学位级别：硕士

真菌病害是植物病害中研究最早和种类最多的,由真菌引起的稻瘟病、纹枯病是最严重影响水稻产量与品质的代表性病害,而防治病害最经济有效的方法是种植抗病品种。由于有生产应用价值的广谱抗病基因很少,因此对已克隆的广谱抗病基因进行... 详细信息

真菌病害是植物病害中研究最早和种类最多的,由真菌引起的稻瘟病、纹枯病是最严重影响水稻产量与品质的代表性病害,而防治病害最经济有效的方法是种植抗病品种。由于有生产应用价值的广谱抗病基因很少,因此对已克隆的广谱抗病基因进行改造利用将是培育抗病品种的重要补充途径。这也将极大的促进农业生产及消除病害防治时施用农药带来的环境污染。本研究利用在种子中低表达、茎叶中全生育期表达的水稻蔗糖合酶基因启动子驱动由水稻几丁质识别受体OsCERK1、OsCEBIP的胞外LMYs、跨膜结构域TM与Xa21胞内近膜结构域JM和蛋白激酶结构域PK组成的嵌合基因(分别命名为：OsCERK1-Xa21、 OsCEBiP-Xa21),将该嵌合基因片段通过植物表达载体导入水稻中,采用常规分子鉴定与田间抗性鉴定手段,获得了对稻瘟病、纹枯病抗性的转基因水稻植株,且通过转基因后代的分子鉴定与抗性调查分析,证实抗性确实是由转基因引起,并可稳定遗传。主要研究结果如下： 1.成功构建了两个用于水稻转化的植物表达载体pCEBiP-Xa21和pOsCERK1-Xa21。 2.利用农杆菌转化系统分别将其转入台北309水稻愈伤组织中,经过多次筛选、分化分别得到再生植株33株和41株。将再生植株移栽于稻田,并对T0代转基因植株进行分子鉴定,PCR检测获得OsCEBiP-Xa21阳性植株为23株,OsCERK1-Xa21阳性植株为38株。 3.用RT-PCR检测技术检测外源基因在转基因植株中的RNA水平是否有表达,随机检测的9个株系中,有8个呈阳性,表明外源基因在RNA水平中有所表达。 4.对T0代转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21基因植株分别接种稻瘟病菌和纹枯病菌进行抗性鉴定,接种稻瘟病菌的结果为10个转基因株系中有7个株系只有少量病斑,表现出对稻瘟病一定程度的抗性;接种纹枯病菌的结果为转基因的10个株系纹枯病病斑长度均低于对照TP309,表现出对纹枯病一定程度的抗性。 5.分别种植转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21的T1代植株15和17个株系,共247株和379株,并且进行PCR鉴定,经鉴定阳性植株分别为185株和278株,其中OsCEBiP-Xa21有6个株系、OsCERK1-Xa21有7个株系基本符合3：1孟德尔遗传分离定律。证明OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21基因可以稳定遗传给后代。 6.提取水稻叶片蛋白,进行Western blot分析,结果显示相对分子质量约65kD处有一条特异性抗体结合带,与预期OsCERK1-Xa21目的蛋白大小相同,说明目的蛋白成功表达。 7.分别对转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21的Tl代植株15和17个株系,共247株和379株,分别接种稻瘟病菌和水稻纹枯病菌进行抗性鉴定。结果显示：与TP309对照组相比,转OsCEBiP-Xa21和《OsCERK1-Xa21的T1代植株均一定程度提高了对稻瘟病菌和纹枯病菌的抗性。 8.分别对转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21的T1代植株15和17个株系,共247株和379株,进行了株高、单株分蘖数、穗长、等5个主要农艺性状进行了考查。结果显示：两种转基因水稻穗长、千粒重、结实率与TP309对照相比均无显著差异性,株高和单株分蘖数这两个农艺性状与TP309对照相比发生了改变,但经分析得出并非是由于转基因所引起,有可能是组培、种植环境等因素影响。

关键词：几丁质嵌合受体抗病性水稻病原相关分子模式

用基因嵌合和定点突变法定位甲酰肽受体的结合结构域

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自然科学进展（国家重点实验室通讯） 1999年第A12期9卷 1234-1240页

作者：朱剑琴张敏跃陆军施晓青朱德煦南京大学医药生物技术国家重点实验室南京大学生物化学系南京210093

N-甲酰肽fMet-Leu-Phe(fMLP)是来源于细菌的化学趋向性小肽。已知fMIP是活化中性颗粒白细胞的强激活剂,因此阐明fMLP受体(FRP)结合fMLP的结构域对控制炎症的发生、中性白细胞在组织中的浸润具有重要意义。用改进的方法构建了FPR的5个嵌... 详细信息

N-甲酰肽fMet-Leu-Phe(fMLP)是来源于细菌的化学趋向性小肽。已知fMIP是活化中性颗粒白细胞的强激活剂,因此阐明fMLP受体(FRP)结合fMLP的结构域对控制炎症的发生、中性白细胞在组织中的浸润具有重要意义。用改进的方法构建了FPR的5个嵌合体及2个突变体,并鉴定了他们结合fMLP的亲和性,取得以下结果:(1)和其他G蛋白偶联性受体不同,FPR的细胞外氨基端结构域(残基1～26)对fMLP结合的重要性不显著。(2)FPR在细胞外的3个环区(loop)对配体的结合是关键性的,其中环区1和环区3尤为重要。(3)FPR的跨膜结构域(TMD)中某些点突变能导致FPR不能和它的配体fMLP充分结合,表明FPR的跨膜结构域也参与对配体的结合。这些结果有助于设计新的FPR颉抗剂。

关键词：甲酰肽受体炎症颉抗剂嵌合受体定点突变法

用基因嵌合和定点突变法定位甲酰肽受体的结合结构域

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自然科学进展 1999年第S1期 3-5页

作者：朱剑琴张敏跃陆军施晓青朱德煦南京 210093 南京大学医药生物技术国家重点实验室南京大学医药生物技术国家重点实验室南京大学生物化学系

关键词：甲酰肽受体 fMLP 嵌合受体化学趋向因子

利用抗人CD19分子的嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞靶向杀伤B淋巴细胞白血病细胞的作用及机制研究

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利用抗人CD19分子的嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞靶向杀伤B淋巴细...

第九届全国免疫学学术大会

作者：王轶楠刘岩厚万继亚杨永广吉林大学第一医院转化医学研究院吉林大学免疫学研究所

背景:巨噬细胞是一种重要的抗肿瘤效应细胞,可以直接杀伤肿瘤细胞,或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。嵌合抗原受体(CAR)技术可不受MHC分子限制靶向杀伤肿瘤细胞,其应用于巨噬细胞能否促进巨噬细胞对肿瘤的杀伤作... 详细信息

背景:巨噬细胞是一种重要的抗肿瘤效应细胞,可以直接杀伤肿瘤细胞,或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。嵌合抗原受体(CAR)技术可不受MHC分子限制靶向杀伤肿瘤细胞,其应用于巨噬细胞能否促进巨噬细胞对肿瘤的杀伤作用,以及能否;逆转肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制特性仍不清楚。目的:明确在巨噬细胞表面表达CAR能否促进其对肿瘤的杀伤作用,能否逆转肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制特性;并尝试通过促进巨噬细胞吞噬功能等手段,更有效杀伤白血病细胞。方法:构建抗人CD19-ScFv-CD64基因完整片段,制备慢病毒,纯化CAR阳性表达的巨噬细胞;检测抗人CD19-CAR-THP-1及对照细胞与人CD19靶细胞的接触功能;应用乳酸脱氢酶释放试验(LDH)检测抗人CD19-CAR-THP-1对靶细胞的特异性杀伤。结果:针对B淋巴细胞白血病细胞表达的CD19分子制备了抗CD19-CAR慢病毒,胞内信号转导域由可活化巨噬细胞的FcgR构成,通过病毒载体携带的GFP标志筛选建立了抗人-CD19-CAR阳性巨噬细胞株;与对照THP-1细胞相比,抗人-CD19-CAR阳性THP-1细胞对靶细胞的吞噬指数显著增高(P嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞靶向杀伤B淋巴细胞白血病细胞的作用及机制正在探讨中。

关键词：靶向治疗 B淋巴细胞白血病嵌合受体 CD19 巨噬细胞 FcgR

来源： cnki会议评论

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靶向修饰树突状细胞免疫治疗肿瘤

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