几丁质识别受体与Xa21的嵌合基因对水稻真菌病害的抗性研究

作     者：曹玉鑫 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏志辉

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：几丁质 嵌合受体 抗病性 水稻 病原相关分子模式 

摘      要：真菌病害是植物病害中研究最早和种类最多的,由真菌引起的稻瘟病、纹枯病是最严重影响水稻产量与品质的代表性病害,而防治病害最经济有效的方法是种植抗病品种。由于有生产应用价值的广谱抗病基因很少,因此对已克隆的广谱抗病基因进行改造利用将是培育抗病品种的重要补充途径。这也将极大的促进农业生产及消除病害防治时施用农药带来的环境污染。 本研究利用在种子中低表达、茎叶中全生育期表达的水稻蔗糖合酶基因启动子驱动由水稻几丁质识别受体OsCERK1、OsCEBIP的胞外LMYs、跨膜结构域TM与Xa21胞内近膜结构域JM和蛋白激酶结构域PK组成的嵌合基因(分别命名为：OsCERK1-Xa21、 OsCEBiP-Xa21),将该嵌合基因片段通过植物表达载体导入水稻中,采用常规分子鉴定与田间抗性鉴定手段,获得了对稻瘟病、纹枯病抗性的转基因水稻植株,且通过转基因后代的分子鉴定与抗性调查分析,证实抗性确实是由转基因引起,并可稳定遗传。 主要研究结果如下： 1.成功构建了两个用于水稻转化的植物表达载体pCEBiP-Xa21和pOsCERK1-Xa21。 2.利用农杆菌转化系统分别将其转入台北309水稻愈伤组织中,经过多次筛选、分化分别得到再生植株33株和41株。将再生植株移栽于稻田,并对T0代转基因植株进行分子鉴定,PCR检测获得OsCEBiP-Xa21阳性植株为23株,OsCERK1-Xa21阳性植株为38株。 3.用RT-PCR检测技术检测外源基因在转基因植株中的RNA水平是否有表达,随机检测的9个株系中,有8个呈阳性,表明外源基因在RNA水平中有所表达。 4.对T0代转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21基因植株分别接种稻瘟病菌和纹枯病菌进行抗性鉴定,接种稻瘟病菌的结果为10个转基因株系中有7个株系只有少量病斑,表现出对稻瘟病一定程度的抗性;接种纹枯病菌的结果为转基因的10个株系纹枯病病斑长度均低于对照TP309,表现出对纹枯病一定程度的抗性。 5.分别种植转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21的T1代植株15和17个株系,共247株和379株,并且进行PCR鉴定,经鉴定阳性植株分别为185株和278株,其中OsCEBiP-Xa21有6个株系、OsCERK1-Xa21有7个株系基本符合3：1孟德尔遗传分离定律。证明OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21基因可以稳定遗传给后代。 6.提取水稻叶片蛋白,进行Western blot分析,结果显示相对分子质量约65kD处有一条特异性抗体结合带,与预期OsCERK1-Xa21目的蛋白大小相同,说明目的蛋白成功表达。 7.分别对转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21的Tl代植株15和17个株系,共247株和379株,分别接种稻瘟病菌和水稻纹枯病菌进行抗性鉴定。结果显示：与TP309对照组相比,转OsCEBiP-Xa21和《OsCERK1-Xa21的T1代植株均一定程度提高了对稻瘟病菌和纹枯病菌的抗性。 8.分别对转OsCEBiP-Xa21和OsCERK1-Xa21的T1代植株15和17个株系,共247株和379株,进行了株高、单株分蘖数、穗长、等5个主要农艺性状进行了考查。结果显示：两种转基因水稻穗长、千粒重、结实率与TP309对照相比均无显著差异性,株高和单株分蘖数这两个农艺性状与TP309对照相比发生了改变,但经分析得出并非是由于转基因所引起,有可能是组培、种植环境等因素影响。