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多穗柯催化根皮素糖基化的糖基转移酶鉴定与功能分析

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多穗柯催化根皮素糖基化的糖基转移酶鉴定与功能分析

作者：张杰华北理工大学

学位级别：硕士

多穗柯中黄酮类化合物含量高,种类丰富,这些黄酮类化合物具有十分重要的药用价值,多穗柯因而被当作药食两用的传统中草药。其中二氢查尔酮类物质根皮苷和三叶苷被证明具有降血糖、降血脂、降血压、抗炎、抗氧化作用。研究发现催化黄酮... 详细信息

多穗柯中黄酮类化合物含量高,种类丰富,这些黄酮类化合物具有十分重要的药用价值,多穗柯因而被当作药食两用的传统中草药。其中二氢查尔酮类物质根皮苷和三叶苷被证明具有降血糖、降血脂、降血压、抗炎、抗氧化作用。研究发现催化黄酮类物质合成的PAL、4CL、CHS和CHI等基因是多穗柯中根皮苷和三叶苷合成的共享基因,而催化根皮素的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT）是二者代谢途径的唯一分支点,是决定根皮苷和三叶苷含量的关键基因。因此从多穗柯中筛选鉴定出能够特异性催化根皮素生成根皮苷和三叶苷的UGT,对于揭示根皮苷和三叶苷含量变化的机制和体外合成二氢查尔酮物质具有十分重要的意义。基于此,本研究通过分析不同根皮苷和三叶苷含量多穗柯中Lp UGT基因的表达水平和代谢物含量之间的相关性,在107条Lp UGT基因中筛选得到4条Lp P2`GT和3条Lp P4`GT。体外催化活性分析验证了Cluster-6439.143031和Cluster-6439.111627蛋白具有催化根皮素生成根皮苷的功能,Cluster-6439.98883蛋白具有催化根皮素生成三叶苷的功能。使用4种化学结构相似的底物芹菜素、柚皮素、柚皮素查尔酮、山奈酚验证了Lp P2`GT（Cluster-6439.143031）和Lp P4`GT（Cluster-6439.98883）蛋白的专一性。酶动力学分析结果表明Cluster-6439.143031蛋白催化根皮素底物的K比Cluster-6439.98883蛋白低,K/K比Cluster-6439.98883高,表明Cluster-6439.143031蛋白对根皮素底物有较高的亲和力和催化效率。分子对接结果显示Lp P2`GT和Lp P4`GT蛋白催化活性位点的构象差异是催化根皮素生成不同糖苷产物的关键;UGT蛋白使根皮素分子质子化的效率能够影响根皮素底物与UDP-葡萄糖的亲核取代反应,表现出Lp P2`GT和Lp P4`GT蛋白催化活性的差异。这些结果证明了Lp P2`GT和Lp P4`GT基因的功能,在分子水平揭示二者不同催化功能以及催化效率差异可能的分子机制;本研究中筛选、鉴定出的Lp P2`GT和Lp P4`GT对于进一步揭示多穗柯根皮苷和三叶苷含量变化的机制和体外合成二氢查尔酮物质具有十分重要的理论和实践意义。图34幅;表20个;参90篇。

关键词：多穗柯尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶根皮素2`-O-糖基转移酶根皮素4`-O-糖基转移酶

基于UDPG原位再生体系合成红景天苷的研究

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基于UDPG原位再生体系合成红景天苷的研究

作者：姜梦嫣北京农学院

学位级别：硕士

红景天苷是红景天植物的有效成分,具有抗辐射、抗缺氧、抗疲劳、抗氧化等作用。单纯依靠野生红景天植物提取红景天苷已无法满足日益增长的需求量,而人工栽培红景天受多方面限制,化学合成法因大量使用有机溶剂而使其安全性堪忧。近年来,... 详细信息

红景天苷是红景天植物的有效成分,具有抗辐射、抗缺氧、抗疲劳、抗氧化等作用。单纯依靠野生红景天植物提取红景天苷已无法满足日益增长的需求量,而人工栽培红景天受多方面限制,化学合成法因大量使用有机溶剂而使其安全性堪忧。近年来,生物法合成红景天苷成为研究热点,但研究多注重于增加底物酪醇的供应量和尿苷二磷酸糖基转移酶的高效表达,常常忽略另一底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的供应。本研究糖合酶可以UDP为底物产生UDPG的原理;利用基因融合的方法构建了蔗糖合酶(SuSy)与尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)的融合酶;通过在大肠杆菌中重组表达融合酶而建立UDPG的原位再生体系,以实现红景天苷的生物合成。研究首先克隆获得了拟南芥蔗糖合酶AtSUS1基因和高山红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶UGT72B14基因;然后依据宿主大肠杆菌密码子偏好性等对所克隆的两个基因序列进行了优化处理,并以酶切位点相连法设计GSG三个氨基酸链接肽序列,将优化后序列连接获得融合基因AtSUS1-3a-UGT72B14,成功构建重组质粒pET28a-AtSUS1-3a-UGT72B14,并转化至大肠杆菌宿主感受态细胞BL21(DE3)中获得重组菌株;之后对重组菌融合蛋白诱导表达条件进行优化,当菌体浓度OD=0.6时添加终浓度为0.6 mM的IPTG,温度设置为16℃进行诱导表达18 h,获得表达量和纯度较理想的重组蛋白;最后经过纯化后进行了重组蛋白的体外酶促反应,反应液经HPLC检测,结合标准曲线计算得到红景天苷的浓度为9.17μg/ml,根据体外酶促反应体系,在酪醇过量的情况下,反应产物相对底物(蔗糖+UDP)的转化率为69.26%。证实了融合体系的运行可以获得产物红景天苷。

关键词：蔗糖合酶尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶融合基因原位再生红景天苷

TaUGT6基因在抗DON毒素积累及赤霉病抗性中的功能分析

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TaUGT6基因在抗DON毒素积累及赤霉病抗性中的功能分析

作者：刘祥西藏大学

学位级别：硕士

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦的一种毁灭性真菌病害,其主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,F.g)引起并可以在全球小麦主产区广泛传播。该病害不仅导致产量减少,而且感病籽粒产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol... 详细信息

小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是小麦的一种毁灭性真菌病害,其主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum,F.g)引起并可以在全球小麦主产区广泛传播。该病害不仅导致产量减少,而且感病籽粒产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)等真菌毒素。DON能够降低小麦品质,威胁人畜健康,而且可以促进赤霉病传播。尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)可以将DON糖基化为低毒的DON-3-葡萄糖苷(DON-3-O-glucoside,D3G),与小麦赤霉病抗性相关。目前小麦庞大的基因组中仅报导了数个UGT,因而对小麦中其他抗赤霉病相关UGT基因的深入发掘与利用是有重要研究意义的。课题组前期发现了一个全新的UGT基因,命名为Ta UGT6。在此基础上,为了解Ta UGT6在抗DON毒素积累及赤霉病抗性中的作用,初步研究了其功能,取得的研究结果如下:1、Ta UGT6基因的克隆和表达模式分析(1)根据Ta UGT6的氨基酸序列和在NCBI中公开的小麦品种中国春序列,搜索Ta UGT6基因全长序列。根据基因的开放阅读窗(Open Reading Frame,ORF)使用Premier 5.0软件设计引物对8920-1F/8920-2R,在苏麦3号基因组DNA中克隆基因全长,苏麦3号中Ta UGT6基因全长为2161 bp,编码490个氨基酸。使用在线工具SMART发现Ta UGT6含有UDPGT结构域,说明该葡萄糖基转移酶可能有催化糖基化反应的功能。使用DNAMAN6.0进行多序列比对和进化树构建发现,Ta UGT6与Ta UGT1/3(32%),Ta UGT2(36%),Ta UGT4(21%)和Ta UGT5(29%)在氨基酸水平上具有较低的相似性,但都包含一个44个氨基酸的UGT共有序列PSPG盒。除了Ta UGT4和Hv UGT13248外,Ta UGT6与已知的糖基转移酶的同源性很高,这表明它们可能具有保守的生物学功能。(2)不同小麦品种Ta UGT6基因的序列比对发现,苏麦3号、安农8455、望水白和扬麦158的Ta UGT6基因ORF序列完全相同,这表明该基因可能具有特定的生物学功能。分析Ta UGT6基因在不同时期组织的表达模式,及在生物和非生物胁迫诱导的表达模式发现,在苏麦3号中,Ta UGT6在抽穗期的旗叶中表达量最高,受禾谷镰刀菌和DON诱导高表达,而且受激素诱导表达,表明Ta UGT6基因与小麦赤霉病抗性相关。然而在感病品种安农8455中,该基因各个组织中表达量都较低,对生物和非生物胁迫诱导均没有明显的响应,推测在安农8455中可能由于某种原因该基因被沉默。2、Ta UGT6基因的遗传转化(1)通过构建原核表达载体p GEX-Ta UGT6,转入大肠杆菌中探索重组蛋白的表达条件,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测发现重组蛋白Ta UGT6-GST最佳诱导条件为:1 mmol/L IPTG在37℃震荡培养6h或者1 mmol/L IPTG在25℃震荡培养过夜。使用蛋白层析系统纯化重组蛋白,并在体外进行酶活性鉴定,发现纯化的Ta UGT6蛋白可以将DON转化为D3G,潜在证明了Ta UGT6在赤霉病抗性中具有抗DON毒素积累作用。(2)通过构建载体p HB-Ta UGT6,进行农杆菌介导的转Ta UGT6拟南芥遗传转化,发现T代转Ta UGT6拟南芥在含有DON的1/2MS平板上生长时可以增强对DON的耐受性。(3)通过构建载体p TCK303-Ta UGT6,以高感赤霉病小麦品种Fielder为受体材料,通过农杆菌介导的方法对Ta UGT6基因进行小麦遗传转化,共获得6个阳性植株。采用单花滴注法进行穗部赤霉病抗性鉴定,在T代抗病鉴定中,在接种第7天,有3个株系与对照相比具有显著差异,初步表明在赤霉病发病前期,Ta UGT6基因过表达可以减缓赤霉病菌在小麦穗部中的扩展速度。在T代抗病鉴定中,降低了赤霉病发病条件,并增加了统计次数。在接种赤霉菌9-15天,转基因株系Ta UGT6-779和Ta UGT6-790的平均病小穗率(percentage of scabbed spikelet,PSS)显著降低,表明Ta UGT6基因在小麦中过表达,在赤霉病发病中期可以减缓赤霉菌在穗部组织中的扩展速度,降低感病小穗率,从而增强小麦穗部中的小麦赤霉病抗扩展抗性。3、Ta UGT6启动

关键词：小麦小麦赤霉病脱氧雪腐镰刀菌烯醇尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶

小麦抗赤霉病相关基因TaUGT3和TaPRP转化普通小麦的研究

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小麦抗赤霉病相关基因TaUGT3和TaPRP转化普通小麦的研究

作者：陈启广南京农业大学

学位级别：硕士

小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是一种主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的,严重危害小麦、大麦等小禾谷类和玉米等作物的真菌性病害。一方面,它能使作物产生病害,直接造成作物减产和品质下降;另一方面,收获的粮食由... 详细信息

小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是一种主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的,严重危害小麦、大麦等小禾谷类和玉米等作物的真菌性病害。一方面,它能使作物产生病害,直接造成作物减产和品质下降;另一方面,收获的粮食由于被DON和其他一些单端孢霉烯类毒素所污染,人和动物误食会产生毒害,严重威胁着人和动物的健康及生命安全。DON是小麦赤霉病菌致病因子之一,它在小麦赤霉病菌和病害发生发展过程中具有重要作用。改良小麦品种抗性、培育和推广抗病品种是控制小麦赤霉病及籽粒DON含量最经济、安全和有效的途径。本实验前期利用Affymetrix小麦基因表达谱芯片分析DON诱导抗病品种望水白的基因表达谱特征,筛选并克隆了一个尿核苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因TaUGT3,将其转化拟南芥能够提高对DON的耐受性,将其导入到普通小麦Alondra's中,在T1代中也鉴定出对赤霉病抗性提高的转基因株系;本实验室还利用Affymetrix小麦基因表达谱芯片,分析和比较望水白及其感病突变体NAUH117穗部组织受赤霉菌诱导的基因表达谱差异,筛选并克隆了3个富含脯氨酸蛋白基因,并将其中一个定位于3D染色体上的Ta-PRP3转化普通小麦扬麦158,在T0代中鉴定出赤霉病抗性提高的转基因植株。本研究在此研究基础之上,分别对TaUGT3以Alondra's为受体的T2代转基因材料以及Ta-PRP3以扬麦58为受体的T1代转基因材料进行赤霉病抗性鉴定,进一步明确这两个基因与赤霉病抗性的关系;构建另外一个定位于3B染色体短臂的富含脯氨酸蛋白基因Ta-PRP1的植物表达载体并进行遗传转化及阳性鉴定,便于研究Ta-PRP1的功能及其与抗赤霉病主效QTL Fhbl的关系。主要研究结果如下：1. TaUGT3与小麦赤霉病抗性以及DON毒素积累的关系根据TaUGT3植物表达载体的序列,设计跨越启动子与目的基因的特异引物对,对TaUGT3的T3代和T3代转基因材料进行PCR鉴定,发现5个株系为转基因阳性株系,从T2代材料的4个系中选取部分单株进行穗部qRT-PCR分析,结果显示其中T1-31和T1-92两个株系的部分单株中目的基因较受体对照Alondra's上调表达。利用单花滴注法对5个转基因株系进行赤霉病抗性鉴定,发现T2-31和T2-92两个株系接种后12天平均病小穗率与受体对照相比差异显著,接种后18天,平均病小穗率与对照相比差异不显著;T2-26株系的平均病小穗率在接种后10天与受体对照相比差异不显著,接种后16天与对照相比差异显著,接种后21天与对照相比差异不显著;T2-20和T2-54与对照相比平均病小穗率差异不显著。根据以上结果推测,TaUGT3是在病原菌扩展时期发挥作用,能够延缓病害的扩展。利用ELISA试剂盒对5个株系籽粒DON含量进行测定,结果发现,T2-26和T2-92株系毒素含量显著低于受体对照,初步说明TaUGT3具有一定解除DON毒素的作用。对T2代和T3转化植株主要农艺性状的调查和分析结果表明,T2-20、T2-26和T2-92三个转基因株系与受体对照相比,株高显著变矮。T3-26和T3-31与对照相比分蘖显著增多,T3-31的穗长显著增加、小穗数显著增多。***-PRP3与小麦赤霉病抗性的关系根据Ta-PRP3植物表达载体的序列,设计跨越启动子与目的基因的特异引物对,对Ta-PRP3转基因材料的T1代7个株系和T2代6个株系进行PCR鉴定,结果显示,T1代7个株系为转基因阳性株系,T2代5个株系为转基因阳性株系。从T1代6个株系中选取部分阳性单株进行qRT-PCR的表达分析,发现其中3个株系的部分单株目的基因较受体对照扬麦158表达上调。利用单花滴注法对T1代材料进行赤霉病抗性鉴定,发现T1-2、T1-9、T1-18、T1-115四个株系与受体对照扬麦158相比,平均病小穗率差异极显著;T1-12、T1-14两个株系与受体对照相比,平均病小穗率差异显著。说明六个转基因株系与受体对照相比,赤霉病抗性水平得到不同程度提高,Ta-PRP3基因在小麦赤霉病抗性中发挥一定的作用。对T1代和T2代转基因植株主要农艺性状的调查和分析结果表明,T1-9株系与受体对照扬麦158相比分蘖数显著增多,T1-12、T1-15较对照显著变矮,T1-18株系较对照显著变高;T2-14株系与扬麦158相比分蘖数显著增多,株高显著增高;T2-2、T2-12与扬麦158相比穗长显著增加;T2-2与扬麦158相比小穗数显著增多。***-PRP1转基因材料的获得构建了Ta-PRP1基因的植物表达载体pBI-Ta-PRP1-HA,利用基因枪法将Ta-PRP1基因与携带Bar基因的表达载体pAHC20共转化到小麦品种扬麦158幼胚愈伤组

关键词：小麦赤霉病抗赤霉病相关基因转基因功能分析富含脯氨酸蛋白尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶

大花红景天UDPGT基因克隆及发根对不同诱导子的响应

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大花红景天UDPGT基因克隆及发根对不同诱导子的响应

作者：常凯西南大学

学位级别：硕士

大花红景天(Rhodiola crenulata)是蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)多年生草本植物,具有肉质匍匐根状茎,为珍稀药用植物,因花、根、茎之浸出液均为红色而得名,主要生长于西藏高原海拔4500米以上的严寒、缺氧、强日照... 详细信息

大花红景天(Rhodiola crenulata)是蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)多年生草本植物,具有肉质匍匐根状茎,为珍稀药用植物,因花、根、茎之浸出液均为红色而得名,主要生长于西藏高原海拔4500米以上的严寒、缺氧、强日照、无污染地带,是红景天中的极品,大花红景天中红景天苷、酪醇、酮等药用成分的含量是其他红景天品种的5倍,被誉为“雪域人参”。其主要次生代谢产物红景天苷具有抗辐射、抗衰老、抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤及改善心血管系统的作用,是一种具有很大发展前景的适用于特殊地区开发的环境适应性药物。但天然药源植物红景天的野生资源数量锐减,且红景天苷含量较低(0.5%～4.1%,DW),其产量远远不能满足市场的需求。化学合成红景天苷成本高、毒性大,所以不能应用于规模生产。近年来,随着大花红景天中红景天苷生物合成途径相关酶基因的克隆,利用基因工程手段提高红景天苷含量成为有效途径之一。本研究采用RACE技术从大花红景天中首次克隆获得了红景天苷合成途径中的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase, UDPGT)基因,命名为RcUDPGT (GenBank登录号：JX228125),并进行了相应的生物信息学分析。分析结果表明,cDNA全长1524bp,其中包含一个长度为1353bp的CDS,编码含有450个氨基酸残基的蛋白。RcUDPGT与其他植物的UDP-葡萄糖基转移酶的同源性较高,与来源于植物、动物、细菌的UDPGTs在发育进化树上聚为3支,RcUDPGT与亲缘关系较近的高山红景天UDPGT聚为一支。该基因所编码的蛋白为亲水性蛋白且定位于细胞质中,二级结构预测RcUDPGT由36.67%α-螺旋、14.67%β-片层和48.67%随意卷曲构成。三级结构预测该基因编码的蛋白具有UDPGT功能结合位点。利用hiTAIR-PCR技术克隆获得UDPGT基因的基因组DNA序列,结果表明RcUDPGT基因的DNA(登录号为：JX228126)编码区域中存在一个82bp的内含子序列。启动子分析表明在第1354-1404bp处存在可能的基础启动子区域分值为0.97,其上游区域可能存在光响应、厌氧响应、热响应、低温响应、压力与防御响应和花色素苷合成响应元件等。建立了大花红景天发根诱导及悬浮培养体系。使用1/2MS+0.2mg/L6-BA的培养基中能够高效的获得质地蓬松、生长迅速且无向地性的优良发根。最佳悬浮培养体系为1/2MS液体培养基,20℃,110rpm黑暗培养。并应用SPSS绘制拟合生长曲线并得到生长动力学Logistic方程为y=2.667/(1+839.79e-30It)。得到拐点湿重A/2=1.33g,拐点天数(1nB)/k=22.36天,曲线拟合度R2=0.99270。选用多种诱导子(MeJA,ABA,ASA,SA,UV,Glucose)处理悬浮培养的大花红景天发根,检测红景天苷生物合成途径中的三个关键酶TyDC,PAL和UDPGT的基因表达量,并测定红景天苷含量。结果表明经过SA处理的红景天苷含量是对照的7.63倍,经过MeJA处理后是对照的4.1倍。结合表达量与含量数据分析其相关系数得到RcTyDC与RcUDPGT基因表达量相关系数为0.9957,与红景天苷含量相关系数为0.8754：RcUDPGT基因表达量与红景天苷含量相关系数为0.8572(相关系数>0.8为具有相关性;相关系数>0.9为具有显著相关性),表明在苯丙烷代谢途径和酪氨酸脱羧途径中,与红景天苷生物合成最为相关的途径是酪氨酸脱羧途径,SA、MeJA处理大花红景天发根能够显著提高TyDC与UDPGT基因的表达量与红景天苷的含量,并为RcUDPGT启动子存在SA与MeJA顺式作用元件的预测提供有力的证据。组织表达谱(yDC,PAL和UDPGT)与含量谱的结果表明,TyDC,PAL和UDPGT三个基因的相对表达量均在茎中最高,红景天苷的含量也在茎中最高,其次为叶、花、根。本研究初步确定了酪氨酸脱羧途径为红景天苷生物合成的主要途径,建立了发根遗传转化体系,并克隆得到(?)UDPGT基因,为今后在大花红景天中研究红景天苷生物合成与代谢工程起到了指示性作用。

关键词：大花红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶发根诱导处理红景天苷

高山红景天UGT72B14-2基因克隆及其原核表达

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北京农学院学报 2016年第4期31卷 7-11页

作者：胡滢滢薛飞燕杨明峰吕鹤书柳春梅马兰青北京农学院植物科学技术学院北京102206 农业部都市农业(北方)重点实验室北京102206

【目的】旨在构建UGT72B14-2的原核表达体系,为进一步研究其功能与应用奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从高山红景天茎叶中分离获取UGT72B14-2基因,在大肠杆菌中表达后,经Ni 2+亲和柱纯化、PD-10柱脱盐处理,利用SDS-PAGE检测目标蛋白... 详细信息

【目的】旨在构建UGT72B14-2的原核表达体系,为进一步研究其功能与应用奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从高山红景天茎叶中分离获取UGT72B14-2基因,在大肠杆菌中表达后,经Ni 2+亲和柱纯化、PD-10柱脱盐处理,利用SDS-PAGE检测目标蛋白。【结果】测序结果表明UGT72B14-2基因长度为1 422bp,预测其编码473个氨基酸,蛋白质相对分子量(Mr)为51.49kDa,等电点(pI)为6.30;SDS-PAGE检测结果表明当初始菌液OD600约0.6时,诱导4h后目标蛋白即可大量表达,纯化、脱盐和浓缩处理后可获得较高纯度的重组蛋白。【结论】UGT72B14-2属于UDP-葡萄糖基转移酶家族的一员,能够在大肠杆菌中表达。

关键词：高山红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶原核表达